角膜损伤修复过程中细胞外基质(ECM)纤维化是角膜瘢痕形成的基础，转化生长因子-β1(TGF-β1)可引起角膜基质过度产生ECM。我们在前期的研究工作中构建了角膜基质三维培养模型，而将TGF-β1添加于该三维培养体系中是否可达到构建角膜基质ECM纤维化的体外三维培养模型有待研究。
评估TGF-β1对该三维培养模型中ECM纤维化相关基因表达的影响，确定该三维培养体系是否可以作为角膜基质ECM纤维化的体外三维培养候选模型。
分离新鲜成年牛角膜，并在基础培养液(DMEM/F12＋体积分数10%胎牛血清)中进行角膜基质细胞的培养，将5×105个牛角膜基质细胞收集于15 ml离心管中构建体外三维培养模型(Pellet)，根据培养液中添加的TGF-β1质量浓度的不同分为基础培养液组(无TGF-β1)、基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组，于培养2周时用钙黄绿素-AM/碘化丙啶法(Calcein-AM/PI)法进行细胞活性测定；分别于培养后48 h、1周和2周应用实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot法检测各组Pellet中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、Col Ⅲ mRNA及其蛋白的表达。
Pellet模型培养后48 h，角膜基质细胞开始抱团，培养后2周经Calcein AM/PI染色证实绝大多数细胞存活。培养后48 h、1周和2周，基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组和基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组角膜基质细胞中α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量均明显高于基础培养液组，3个组间的总体差异均有统计学意义(F分组＝696.745，P<0.001；F分组＝35.166，P<0.001；F分组＝33.677，P<0.001)，且随着培养时间的延长，α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量逐渐升高，差异均有统计学意义(F时间＝5.863，P<0.05；F时间＝298.614，P<0.001；F时间＝607.472，P<0.001)；Col Ⅲ mRNA合成速率均大于Col Ⅰ mRNA的合成速率；Western blot检测发现，培养后48 h和1周α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白的表达量为微量，培养后2周基础培养液＋0.5 ng/ml TGF-β1组Pellet模型中α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白的相对灰度表达量分别为0.395±0.208、1.060±0.175和0.629±0.382，基础培养液＋1.0 ng/ml TGF-β1组α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ蛋白的灰度表达量分别为0.758±0.228、1.201±0.187和0.753±0.468，组间总体比较差异均有统计学意义(α-SMA：F＝10.691，P<0.05；Col Ⅰ：F＝14.094，P<0.05；Col Ⅲ：F＝10.995，P<0.05)。
培养液中添加TGF-β1和血清促进角膜ECM的纤维化，表现为Pellet三维培养模型中牛角膜基质细胞高表达纤维化特异性标志物。该培养体系可作为角膜基质ECM纤维化研究的体外三维培养模型。
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角膜基质瘢痕形成是导致角膜外伤、炎症修复后的角膜基质失去透明性的组织学基础，寻找减少瘢痕形成的方法一直是角膜创伤修复的研究热点。细胞的体外三维培养技术逐渐发展和成熟[1, 2]，为二维单层培养细胞方法向动物实验研究的技术转化建立了桥梁。目前，三维培养的细胞主要应用于组织工程学研究及药物的筛选。近年来，有研究利用不同的体外三维培养模型进行角膜基质细胞对生长因子反应的研究[3, 4]。我们前期的研究建立了牛角膜基质细胞的体外三维培养模型[5]，本研究拟在此基础上于培养体系中添加转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)进行长期培养，评估该培养体系作为角膜基质纤维化体外三维培养模型的可行性。
