成体干细胞的命运与其生存的微环境密切相关。研究表明，胚胎干细胞(ESCs)微环境能增强人角膜缘干细胞(LSCs)的干性，其作用机制是研究热点。
探讨干细胞微环境增强LSCs的干性及其抑制细胞凋亡的分子机制。
将129小鼠ES细胞株(E14细胞)分别用CnT-20培养液和CnT-20＋体积分数20%ES(ESC-CM)培养液进行培养和传代。采用新鲜供体人角膜缘组织块培养法，分别用CnT-20培养液和ESC-CM培养液培养和传代LSCs，细胞经固定后于光学显微镜下观察细胞克隆形态并计算克隆形成率(CFE)。ESC-CM培养组细胞分别转染端粒酶逆转录酶(TERT)siRNA(19-25nt siRNA)或siRNA(sc-37007)，流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡、线粒体膜电位的改变；采用免疫荧光技术和流式细胞技术检测siRNA转染前后细胞中端粒酶的表达和活性氧簇(ROS)的产生情况；采用RT-PCR、免疫荧光技术和Western blot法检测细胞中干细胞标志物p63、三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)、整合素β1(integrin β1)和细胞分化标志物细胞角蛋白3(CK3)mRNA及其蛋白的表达；采用Western blot法检测细胞中黏着斑激酶(FAK)、Akt和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)及其磷酸化蛋白以及p21蛋白的改变。
ESC-CM培养组LSCs可传至第8代，CFE为(7.6±0.6)%，CnT-20培养组传至第6代，CFE为(5.6±0.6)%，差异有统计学意义(t＝4.454，P＝0.011)；ESC-CM培养组第2、3、4、5、6代LSCs的凋亡百分比均明显低于CnT-20培养组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；siRNA-F转染细胞的凋亡率为(7.7±1.3)%，明显低于siRNA-TERT转染细胞的(32.3±3.1)%，差异有统计学意义(t＝－12.588，P＝0.000)。ESC-CM培养组与CnT-20培养组的原代LSCs中干细胞标志物mRNA及其蛋白、TERT蛋白的相对表达量差异均无统计学意义(均P>0.05)，但ESC-CM培养组CK3 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显低于CnT-20培养组，差异均有统计学意义(均P<0.01)；ESC-CM培养组第2代细胞中干细胞标志物蛋白及TERT蛋白表达量均明显高于CnT-20培养组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。siRNA-TERT转染组细胞端粒酶活性为(4.83±0.67)%，明显低于siRNA-F转染组的(46.71±1.22)%，差异有统计学意义(t＝52.116，P＝0.000)。ESC-CM培养组培养液中添加了FAK抑制剂和GSK3β抑制剂以及转染TERT-siRNA后，细胞中pFAK、pAkt、pGSK3β的表达明显减弱，而p21的表达增强。ESC-CM培养组第2代LSCs及siRNA-F转染组细胞的线粒体膜电位明显高于CnT-20培养组和siRNA-TERT转染组，差异均有统计学意义(均P<0.01)；ESC-CM培养组原代和第2代细胞中及siRNA-F转染组细胞中ROS表达比例均明显低于CnT-20培养组及siRNA-TERT转染组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。
ESC-CM培养体系可促进LSCs干性的维持，抑制细胞凋亡，其机制可能与端粒酶-p21-线粒体通路及FAK/Wnt信号通路的激活有关。
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干细胞具有细胞周期长、增生能力强、有自我更新和多向分化等特性，其在机体修复及疾病治疗方面具有广阔的应用前景，是近年来研究的热点。干细胞内部信号与外部微环境对其干性的维持非常重要[1]，研究表明，成体细胞的生物学特性可以被其周围的干细胞微环境所改变[2, 3]。无活性的老年鼠肌肉卫星干细胞可受年轻鼠的同种干细胞产生的一些因子的影响而恢复活力和功能[4]，年老牙周干细胞衰减的增生和分化能力可在青年牙周干细胞条件培养液得到增强[5]。胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)条件培养液具有促进增生及抑制凋亡的作用[6, 7, 8]。我们先前的研究发现，ESCs微环境具有促进细胞增生的作用，可以减缓甚至逆转成体细胞的老化[9, 10]，ESCs处理后的兔角膜上皮细胞在22周内就可以连续传代超过55代，甚至通常情况下不能增生的人和猫角膜内皮细胞也可获得较强的增生与传代能力[11]。经过该系统处理的已分化成体细胞的增生能力明显增强，表现为细胞融合加快、倍增时间缩短、克隆形成率(colony-forming efficiency，CFE)增加，而且可使细胞保持原来的生物学特性。随着增生传代的进行，成体细胞逐渐恢复其前体细胞的某些特性，如角膜上皮前体细胞标记P63和三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette transporer G2，ABCG2)等蛋白的表达水平均明显增高，角膜上皮细胞终末阶段的特异性标志物细胞角蛋白3(cytokeratin3，CK3)/CK12表达下降，更为重要的是，所获得的细胞中并未检测到细胞中Oct-4的表达。以上这些研究结果充分说明ESCs微环境作用的细胞具有良好的生物安全性，无向肿瘤转化的倾向[9, 11]。研究表明，角膜缘干细胞(limbal stem cells，LSCs)具有活性端粒酶的表达[12, 13, 14]。ESCs条件培养液使角膜上皮细胞获得强大增生能力的作用可能是通过激活整合素β1(integrin β1)-黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)-PI3K/Akt而实现的，提示在ESCs微环境培养体系中可能存在端粒酶相关信号通路来调控成体细胞/成体干细胞的衰老与分化[15]。但目前对胚胎环境如何延缓，甚至逆转机体及其细胞的衰老的机制尚缺乏深入系统的研究，本研究在既往研究的基础上，拟从端粒酶调控机制入手，确立端粒酶信号通路在ESCs微环境增强成体干细胞增生能力中的机制。
