组织工程角膜学的发展为角膜盲的治疗提供了新的选择，但目前暂未发现培养方法简单、可行性好的角膜上皮种子细胞和理想的支架材料。研究表明，脂肪源性干细胞(ADSCs)具有自我更新能力同时也具有类上皮的特质，而温度敏感性材料(TRSs)作为支架进行干细胞培养也为细胞层片技术的进步提供了技术支撑。
研究兔ADSCs在TRSs上的培养特性，并与经典的口腔黏膜上皮细胞(OMECs)特性进行比较，探讨ADSCs作为眼表重建种子细胞的可行性。
异丙基丙烯酰胺溶于二丙醇后均匀涂于直径35 mm的聚苯乙烯培养皿表面，利用电子束照射制备TRSs，兔颈背部皮下脂肪组织2～3 g经消化培养后获得ADSCs，同时取出兔口腔黏膜组织进行消化培养，获得OMECs。将2种干细胞均接种于TRSs上继续培养，比较2种细胞形态、生长速度、脱附时间和成活细胞的总计数，将ADSCs层片和OMECs层片行组织病理学检查，观察2种细胞的形态特征；采用免疫组织化学法检测2种细胞中干细胞标志物和上皮细胞标志物的表达；应用扫描电子显微镜检查2种细胞层片的表面超微结构。
自制TRSs透明性和光滑度与普通培养皿接近，任意观察的5个样品中有4个水接触角>10°，成功率为80%。TRSs上培养的ADSCs呈长梭形，OMECs呈不规则圆形。ADSCs生长周期在TRSs上为12～14 d，脱附时间为(46. 0±9. 6)min，细胞总计数为(7. 9±1. 1)×105/片，而TRSs培养的OMECs生长周期为14～16 d，脱附时间为(91. 9±10. 9)min，细胞计数为(45. 8±26. 5)×105/片，2种细胞间层片脱附时间和细胞计数的差异均有统计学意义(P＝0. 002、0. 028)。组织病理学检查显示，TRSs上的ADSCs呈1～3层排列，而OMECs呈4～5层覆层结构。免疫组织化学染色显示，ADSCs和OMECs细胞层片细胞角蛋白12(CK12)及干细胞标志物p63、ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)均呈阳性表达。扫描电子显微镜下观察可见ADSCs和OMECs表面均有致密的上皮微绒毛结构，细胞间连接紧密。
自制的TRSs可作为脂肪干细胞的培养支架，ADSCs取材广泛，TRSs上培养的ADSCs层片细胞活力好，可操作性强，可作为眼表重建新的种子来源。
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角膜病是全球范围内主要的致盲原因之一，组织工程角膜研究的进步和发展为角膜盲患者开辟了新的治疗途径。近年来，角膜上皮种子细胞的研究获得了巨大进展，自体角膜上皮细胞、角膜缘干细胞(Limbal stem cells，LSCs)、口腔黏膜上皮细胞(oral mucosal epithelial cells，OMECs)、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞及表皮来源的干细胞等均可作为角膜上皮重建的来源，其中自体角膜上皮细胞、LSCs和OMECs已用于临床并取得了较理想的疗效[1,2,3,4,5,6]。目前角膜上皮细胞、LSCs及OMECs的体外培养均需要鼠3T3细胞作为滋养层提供促生长、上皮分化的营养因子[1,2,3]，存在伦理问题，同时3种细胞的体外培养条件较苛刻，技术要求较高，因此限制了其临床应用。体外培养的脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)可表达多功能干细胞标志物及角蛋白，提示ADSCs具有自我更新能力，同时也具有类上皮的特质[7]，这为ADSCs应用于眼表重建提供了理论基础。与种子细胞研究的长足发展不同，支架材料一直制约着组织工程角膜研究的发展。细胞层片技术(cell sheet technology，CST)的应用实现了不需支架即可成功移植植片的目标，避免了传统支架材料联合植片移植引发的免疫排斥、炎症反应、光学干涉等问题。将细胞接种于异丙基丙烯酰胺(poly-N-isopropylacrylamide，PNIPAAm)处理/辐射接枝过的培养皿表面，并在37 ℃温箱中培养数日，待细胞汇合成片时，调控培养温度，细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)可从材料表面完整脱附，此时PNIPAAm仍可完整贴附在皿表面，体外培养的角质细胞、角膜上皮细胞及OMECs在20 ℃时脱附，细胞层片完整、连续且保存原有的结构和功能[8]。ECM可维持细胞的活力，促进黏附、增生和分化，同时加快植片与宿主的整合以及植片与植片间的叠加[8,9]。本研究中在自制温度敏感性材料(temperature-responsive scaffolds，TRSs)上培养ADSCs及OMECs，比较2种细胞体外培养的生长特性，探讨ADSCs作为眼表重建种子细胞的可能性。
