研究表明，CD4＋CD25＋自然调节性T细胞(nTregs)在维持外周免疫耐受及自身免疫平衡中起到重要作用，而体外诱导和扩增的诱导性调节性T细胞(iTregs)可通过过继转移的方式抑制器官移植的免疫排斥反应。目前iTregs的诱导方法仍在不断优化，且其对角膜移植的作用尚不明确。
研究iTregs的体外诱导和扩增方法，及其在体内对免疫排斥反应的抑制作用和在体外对效应T细胞(Teffs)增生的抑制作用。
从C57BL/6小鼠股骨骨髓组织中提取和培养骨髓来源树突状细胞(BMDCs)；取BALB/c小鼠脾脏，磁珠分选CD4＋CD25＋ T细胞和CD4＋CD25－ T细胞，将CD4＋CD25－ T细胞分为阴性对照组(单纯CD4＋CD25－ T细胞)、CD3/28抗体珠组(CD4＋CD25－ T细胞＋抗鼠CD3/28抗体珠)、2.5 ng/ml转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导组和10.0 ng/ml TGF-β1诱导组。在不同质量浓度TGF-β1和抗CD3/CD28抗体珠(细胞和抗体珠比例为1∶1)条件下诱导iTregs的生成，并使用抗CD3/CD28抗体珠(细胞和抗体珠比例为1∶2)、白细胞介素-2(IL-2)和TGF-β1体外扩增iTregs。采用流式细胞仪检测Tregs各表面因子的表达，采用混合淋巴细胞反应分析体外扩增iTregs对Teffs的抑制能力。建立同种异体小鼠角膜移植模型(C57BL/6→BALB/c)，并将模型分为nTregs注射组、iTregs注射组和PBS组；根据分组经小鼠对侧眼球后静脉丛分别注射0.1 ml nTregs、体外扩增iTregs悬液和PBS，观察注射后3个组小鼠植片情况。
阴性对照组、CD3/28抗体珠组、2.5 ng/ml TGF-β1诱导组和10.0 ng/ml TGF-β1诱导组中CD4＋CD25－ T细胞表达CD4＋CD25＋ T细胞的比例分别为(6±3)%、(91±4)%、(91±3)%和(86±6)%，其中CD3/28抗体珠组、2.5 ng/ml TGF-β1诱导组和10.0 ng/ml TGF-β1诱导组CD4＋CD25＋ T细胞比例明显高于阴性对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。CD3/28抗体珠组、2.5 ng/ml TGF-β1和10.0 ng/ml TGF-β1诱导组Foxp3＋ T细胞比例分别为(1.18±0.20)%、(8.70±1.80)%和(21.80±3.36)%，其中2.5 ng/ml TGF-β1诱导组和10.0 ng/ml TGF-β1诱导组Foxp3＋ T细胞比例明显高于CD3/28抗体珠组，且10.0 ng/ml TGF-β1诱导组Foxp3＋ T细胞比例明显高于2.5 ng/ml TGF-β1诱导组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。体外扩增iTregs中CD69＋ T细胞比例明显低于nTregs，PD-1＋、Foxp3＋和CD25＋ T细胞比例均明显高于nTregs，差异均有统计学意义(均P<0.01)。在1∶1、1∶2、1∶4、1∶8和1∶16 Tregs/Teffs比例条件下，iTregs与Teffs混合培养后Teffs的增生能力明显低于nTregs与Teffs混合培养组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。iTregs注射组角膜植片存活时间为4周，永久耐受者占50%，而nTreg组小鼠角膜植片的存活时间为3周，永久耐受者占17%，2个组比较差异有统计学意义(P<0.05)。
TGF-β1可诱导CD4＋CD25－ T细胞生成iTregs并高表达Foxp3，体外扩增iTregs较nTregs具有更强的抑制淋巴细胞增生能力，从而抑制角膜移植排斥反应的发生。
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角膜盲是眼科主要可治疗盲之一，穿透角膜移植术是目前主要的治疗方法。尽管角膜是器官移植的免疫赦免部位，但同种异体免疫排斥反应仍然是角膜移植术失败的主要原因，因此降低角膜移植术后免疫排斥反应，达到角膜植片长期存活尤为重要。调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是一类具有免疫负向调节作用的细胞总称，表型为CD4＋CD25＋，其特异性标志物为Foxp3，其中自然调节性T细胞(natural Tregs，nTregs)在维持外周免疫耐受及自身免疫平衡方面发挥重要作用，而体外诱导和扩增的诱导性Tregs(induced Tregs，iTregs)则起到加强和过继nTregs的作用。效应T细胞(effector T cells，Teffs)是一类具有免疫正向调节作用的细胞总称，表型为CD4＋CD25－，Tregs与Teffs间的平衡对于预防和控制自身免疫性疾病的发生和发展至关重要。研究显示，将BALB/c小鼠来源的CD4＋TCD25－ T细胞注射到BALB/c无胸腺裸鼠体内可引起裸鼠发生自身免疫性疾病[1]，表明外周血和组织中胸腺来源的nTregs在啮齿动物和人类免疫耐受中起重要作用。多项研究已证实，Tregs表面可表达肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)受体，并表现出免疫相关调节功能[2,3,4]。治疗自身免疫性疾病的理想方法并不是去除自身Teffs，而是减少其细胞数量，尤其是病理性和记忆性T细胞，更重要的是诱导和扩增Tregs细胞数量，调节Tregs和Teffs之间的平衡。多种方式参与调节Tregs和Teffs之间的平衡，如CD3、CD4和CD40L单克隆抗体治疗可以减少抗原特异性T细胞的数量而不影响Tregs，从而达到Tregs占主导的免疫状态；Akt-mTOR通道抑制剂雷帕霉素可增加Tregs的Foxp3转录[5]；组蛋白去乙酰基酶抑制剂曲古霉素A可促进Foxp3的乙酰化，从而促进Foxp3＋ Tregs的扩增[6]；目前有多种方法可以生成iTregs以治疗自身免疫性疾病、过敏、炎性疾病和移植耐受等疾病[7]。本研究中探讨iTregs的诱导过程及其对鼠角膜移植排斥反应的治疗作用，为细胞疗法在临床上的应用提供实验依据。
