准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术(LASEK)是目前主要的屈光矫正术式之一，但术中使用的乙醇可引起角膜上皮的损伤。胸腺素β4(Tβ4)具有抗凋亡等多种生物学作用，但其对乙醇所致的角膜上皮细胞损伤是否具有保护作用尚不清楚。
研究Tβ4对乙醇诱导的角膜上皮细胞损伤是否具有预防作用。
收集10只健康成年新西兰白兔的角膜，采用组织块培养法获得兔原代角膜上皮细胞传代，逆转录PCR(RT-PCR)法检测缝隙连接蛋白connexin 43和成熟角蛋白keratin 12的表达情况，对细胞进行鉴定。选取第2代处于对数生长期的细胞均衡分为4个组，正常对照组细胞进行常规培养，Tβ4组细胞在培养液中添加终浓度为1 μg/ml的Tβ4，乙醇组细胞用含体积分数20%乙醇的PBS作用20 s以制备角膜上皮细胞损伤模型，乙醇＋Tβ4组在损伤模型培养液中加入Tβ4。采用MTT法检测各组角膜上皮细胞存活率；采用TUNEL法观察角膜上皮细胞的凋亡情况；采用实时荧光定量PCR法检测各组角膜上皮细胞中细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)mRNA的相对表达量；应用ELISA法检测各组角膜上皮细胞中bcl-2蛋白的质量浓度；用分光光度法检测细胞裂解液中caspase-3酶活性。
MTT法结果显示，正常对照组细胞存活率设定为100%，乙醇组细胞存活率为(52.1±14.07)%，明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P＝0.001)；乙醇＋Tβ4组细胞存活率为(77.7±19.60)%，明显高于乙醇组，差异有统计学意义(P＝0.035)。TUNEL染色显示，乙醇组和乙醇＋Tβ4组均可见明显的TUNEL阳性染色细胞，乙醇＋Tβ4组阳性细胞百分比为(30.0±6.7)%，明显低于乙醇组的(42.4±4.0)%，差异有统计学意义(P＝0.01)。实时定量PCR显示，乙醇＋Tβ4组细胞中Cyclin D1 mRNA和CDK4 mRNA的相对表达量分别为0.93±0.17和0.88±0.09，均明显高于乙醇组的0.68±0.05和0.54±0.07，差异均有统计学意义(P＝0.027、0.002)。ELISA显示，乙醇组细胞中bcl-2蛋白质量浓度明显低于乙醇＋Tβ4组，而caspase-3酶活性则高于乙醇＋Tβ4组，差异均有统计学意义(P＝0.030、0.021)。
Tβ4对乙醇诱导的角膜上皮细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能是通过降低角膜上皮细胞中caspase-3酶活性和增加bcl-2蛋白质量浓度来阻止乙醇所致的细胞凋亡；Tβ4也可上调角膜上皮细胞中Cyclin D1及CDK 4的表达，以调控细胞分裂和增生，促进角膜上皮损伤的愈合。
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准分子激光角膜屈光手术是目前屈光矫正常见的术式之一。与准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy，PRK)相比较，准分子激光角膜上皮瓣下磨镶术(laser assisted subepithelial keratectomileusis，LASEK)术后视力恢复快且能保持稳定，术眼疼痛感轻；此外，LASEK术中和术后角膜瓣的相关并发症较准分子激光原位角膜磨镶术(laser assisted in-situ keratomileusis，LASIK)少，且角膜较薄者能够最大限度地保留一定的角膜基质厚度，因此目前LASEK在近视矫正手术中应用较为广泛[1,2]。但LASEK术中乙醇对角膜上皮细胞具有潜在的毒性作用。研究表明，乙醇可引起细胞凋亡，降低细胞活性，而角膜上皮细胞活性受损、角膜上皮延迟愈合是影响术后视力的重要因素，受损角膜上皮细胞释放的细胞因子可以诱导级联反应，并作用于角膜基质细胞，导致角膜haze的发生和瘢痕的形成[3,4,5]。因此保护角膜上皮细胞免受损伤，是减少术后并发症的有效方法。胸腺素β4(thymosin β4，Tβ4)是由43个氨基酸残基组成的、高度保守的水溶性多肽，是胸腺素β家族中分布最广，含量最多的一员，具有多种生物学功能，如调节肌动蛋白、促进细胞迁移、调控炎症反应、抑制细胞凋亡、促进皮肤损伤愈合等作用[6,7,8,9]。我们前期的研究表明，Tβ4可阻止氧化应激损伤所致的角膜上皮细胞的凋亡，但Tβ4对于乙醇所致的角膜上皮细胞损伤、凋亡的作用及机制尚未完全明了[10]。本研究拟探讨Tβ4对乙醇诱导的角膜上皮细胞凋亡的保护作用及其机制为Tβ4用于LASEK术后角膜上皮损伤的预防和治疗提供依据。
