随着视网膜色素上皮(RPE)细胞视网膜下腔移植治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)研究的开展，需要优化无动物源性成分(xeno-free)培养体系快速定向诱导人胚胎干细胞(hESCs)向RPE细胞分化以满足日渐增长的科研及临床需要。
建立xeno-free培养体系，优化快速诱导hESCs向RPE细胞分化的方法。
将hESCs克隆团接种至Vitronectin XF™，在培养液中加入50 ng/ml noggin、10 ng/ml DKK-1以及10 ng/ml胰岛素样生长因子-1(IGF-1)培养2 d，第2～4天将培养液中noggin质量浓度减至10 ng/ml，并加入5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，第4～6天移除培养液中的noggin和bFGF，第8～14天培养液中加入1 μmol/L CHIR99021。倒置显微镜下观察ESCs在分化为RPE细胞过程中的形态变化，免疫荧光染色检测细胞内特异性抗原的表达以对分化细胞进行鉴定，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测细胞分化过程中RPE细胞特异性蛋白mRNA的相对表达变化量。
分化培养第14天，部分细胞呈多角形并呈现铺路石样排列，且细胞内可见色素颗粒；培养第35天，诱导分化的细胞内表达RPE细胞特异性抗原Mitf及RPE65；培养至第60天，细胞内富含黑色素颗粒且呈规则六边形。与诱导分化前比较，诱导分化第7天和第14天hES-RPE细胞中Mitf mRNA的表达量分别增加了(3.43±2.77)倍和(8.91±2.83)倍，而RPE65 mRNA的表达量分别增加了(14.60±3.94)倍和(87.16±9.32)倍，分化第7天和第14天细胞中的Mitf mRNA和RPE65 mRNA的相对表达量均明显高于分化前，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
hESCs可在含尼克酰胺、DKK-1、noggin、IGF-1和CHIR99021的xeno-free优化培养体系中快速分化为RPE细胞。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是西方发达国家65岁及以上人群首位致盲病因，亦是中国65岁以上人群重要的致盲疾病之一，且随着人口的老龄化以及人类平均寿命的不断提高，AMD的患病率逐年升高，给患者家庭以及社会带来了极其沉重的负担[1]。目前，多种抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物被批准应用于治疗眼内新生血管性疾病，给湿性AMD的治疗带来了突破性的进展，然而，针对干性AMD导致的视力下降尚无有效的防治方法。既往研究认为，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞吞噬和屏障功能障碍和细胞凋亡在AMD的病理过程中起到关键作用[1,2]，因此RPE细胞移植为干性AMD的治疗提供了新的途径。目前，日本及美国学者已开展诱导多潜能干细胞源性RPE(induced pluripotency stem cell derived retinal pigment epithelium，iPSC-RPE)或胚胎干细胞源性视网膜色素上皮(embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium，ES-RPE)细胞视网膜下移植治疗干性AMD的临床试验，并取得了一定成效[3,4]，但由于iPSC分化为RPE细胞大多存在耗时较长、方法复杂、可能受到异种动物源蛋白污染等问题，故难以获得足量的治疗级细胞，成为限制hES-RPE细胞临床应用的瓶颈之一。本研究中拟探索在无动物源性成分(xeno-free)培养体系中快速诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)向RPE细胞分化的方法。
