目前角膜供体来源短缺，且体外培养的人角膜内皮细胞(HCECs)难以再生和扩增，为临床上角膜移植的开展带来了很大困难，组织工程角膜的构建仍是研究的主要课题。前期研究已证实，小鼠胚胎干细胞条件培养基(ESC-CM)能够促进体外HCECs的增生，脱细胞猪角膜基质(APCS)是较好的支架材料，但ESC-CM培养的HCECs是否能在APCS上融合成单层细胞鲜见研究。
研究ESC-CM培养的HCECs在APCS上是否能够形成单层细胞。
用小鼠ESC-CM培养液培养小鼠ES-E14细胞，收集培养上清液，离心后按体积比1∶3与人角膜内皮细胞培养液(CEM)混合，制备体积分数25%ESC-CM液。取穿透角膜移植术后剩余的供体人角巩膜缘组织，采用组织块培养法用ESC-CM对HCECs进行培养和传代，采用逆转录PCR法检测HCECs中Ⅷ型胶原蛋白(Col Ⅷ)与神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞。取猪角膜，利用磷脂酶A2和碳酸氢盐溶液脱细胞法制备APCS，将第2代HCECs混合液按照800/mm2的密度种植于灭菌的APCS上进行培养，于倒置相差显微镜下观察细胞形态，采用苏木精－伊红染色法观察培养细胞的组织结构；采用免疫荧光法检测构建的HCECs单细胞片中闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和Na＋-K＋-ATP酶的表达。
体外培养的HCECs呈典型的六角形，内皮特异性标志物Col Ⅷ和NSE mRNA表达阳性。脱细胞APCS呈白色透明状，苏木精－伊红染色显示APCS中无角膜细胞，但角膜胶原纤维排列规则。第2代HCECs复水后可在APCS上生长并贴附，培养后7 d融合成单层细胞片，细胞片上HCECs的细胞密度为(2 694±143)/mm2。构建的HCECs片中内皮细胞泵功能相关蛋白ZO-1和Na＋-K＋-ATP酶均呈阳性表达，呈红色荧光。
25%ESC-CM可促进HCECs的生长并维持细胞的正常形态，APCS可为HCECs片的构建提供支架和较好的生存微环境。在APCS形成的HCECs单细胞片可表达HCECs泵功能，是角膜移植的良好供体。
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根据世界卫生组织2001年的统计结果，全球每年约有1千万患者需要行角膜移植术，但角膜供体的来源远远不能满足患者的需求，角膜材料的短缺使部分患者遭受角膜盲[1]。自从1999年Griffith等[2]使用细胞株成功进行组织角膜的构建，很多实验室一直致力于组织工程角膜的研究。目前组织工程角膜内皮细胞(corneal endothelial cells，CECs)片的研究存在2个瓶颈问题，一是如何在短期内实现具有CECs泵功能的人角膜内皮细胞(human corneal endothelial cells，HCECs)的体外大量扩增；二是寻找既能为角膜细胞提供良好微环境，又具有较好的透光性及生物力学、适合体内移植的低免疫原性的支架材料。目前已有角膜胶原及后弹力层、微粒凝胶、新型明胶、温敏材料等HCECs片，但HCECs体外培养效率均较低，且HCECs片仅适用于有CECs损伤的疾病，对一些严重疾病导致的全层角膜损伤来说，需要一种生物相容性更好、更适合各种角膜细胞生长的细胞支架。我们前期的研究证实，小鼠胚胎干细胞条件培养基(mouse embryonic stem cell conditioned medium，ESC-CM)可以促进HCECs的增生并能维持HCECs的功能和形态[3,4]，脱细胞猪角膜基质(acellular porcine corneal stroma，APCS)作为一种支架材料，具有较强的生物力学强度和较高的透明度，应用后可在角膜缘区域保留角膜缘干细胞的细胞龛结构，有利于角膜细胞的增生[5,6,7]，但ESC-CM培养的HCECs能否在APCS上较好地生长并融合鲜见报道。本研究中拟观察ESC-CM培养的HCECs在APCS上是否能够形成适合全层移植的具有CECs功能的HCECs片。
