视网膜色素上皮(RPE)细胞移植是目前人类尝试治疗视网膜色素变性(RP)的主要手段。诱导多能干细胞(iPSCs)将成为移植细胞的一个重要来源，人胚胎干细胞(hESCs)可以无限期地自我更新和分化，是RPE细胞移植的重要供体来源。此外，iPS-RPE细胞为患者自身细胞成为治疗源组织提供了个性化治疗平台。
评估利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种基因导入RP患者皮肤成纤维细胞后诱导人iPSCs的可行性，并建立将正常人iPSCs诱导分化为RPE细胞的方法。
分别采集基因突变点为SNRNP200 p．S1087L的RP患者及无SNRNP200 p．S1087L突变受试者的大腿皮肤组织块约2 cm×3 cm。采用胰蛋白酶消化和组织块培养法分离纯化得到成纤维细胞并进行传代，取第3代细胞用于研究，分别采用形态学和免疫荧光技术对培养细胞进行鉴定。采用含OCT4、SOX2、C-MYC和KLF4 4种cDNA的质粒病毒转染的成纤维细胞，并用hESCs条件培养液诱导iPSCs，采用细胞形态学、碱性磷酸酶(AP)染色、干细胞表面多潜能标志物表达对所得到的iPSCs和iPS-RPE细胞进行鉴定，并通过细胞在SCID小鼠的体内种植考察iPSCs的成瘤性。采用诱导分化拟胚体(EB)法将不含SNRNP200 p．S1087L突变的iPSCs诱导分化为RPE细胞，分别采用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR法检测细胞中特异性蛋白的表达。
用皮肤组织块培养的成纤维细胞呈梭形和多角形，光学显微镜下可见细胞间排列紧密，细胞形态和大小趋于一致，细胞中特异性蛋白Vimentin表达阳性。经逆病毒转染的成纤维细胞培养后第5～7天可见小的细胞聚集，细胞形态由梭形变为圆形；培养后20 d出现类似hESCs集落形态的iPSCs克隆；培养后25～30 d细胞中的标志物SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81及Nanog均呈阳性表达，培养后12周形成的iPSCs克隆中AP染色阳性，接种到SCID小鼠体内后形成畸胎瘤。免疫荧光染色显示，诱导分化后30 d时iPS-RPE细胞中RPE细胞特异性标志物RPE65、闭锁小带蛋白1(ZO-1)和卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)蛋白均呈阳性表达。
利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种基因转入SNRNP200 p．S1087L突变的RP患者皮肤成纤维细胞后可以获得iPSCs，建立的iPSCs有ESCs的形态和多能分化的特征。采用同样的转染技术可在无SNRNP200 p．S1087L突变的人皮肤成纤维细胞中建立体外高分化、高效能的iPS-RPE细胞。
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视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是以视网膜感光细胞和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)功能受损所致的退行性病变，是临床常见的遗传性视网膜疾病(hereditary retinal disease，HRD)，其临床特征是夜盲、进行性视野缩小、视网膜成骨细胞样色素沉着和光感受器功能障碍，目前尚无有效方法阻止或逆转此病的进展。近年来已尝试应用基因疗法和细胞移植法治疗视网膜变性疾病，其主要策略是RPE细胞移植，但如何获取数量充足、排斥性和成瘤性低的RPE细胞是主要问题。研究表明，人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)因具有全能分化特性以及无限增生能力而被认为是治疗视网膜变性疾病安全和有效的方法，但存在伦理问题和免疫排斥问题。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是自体来源细胞，iPS细胞移植可避免伦理问题和免疫排斥问题。研究表明，iPSCs能体外诱导分化成人光感受器样细胞和RPE样细胞，并能表达光感受器细胞和RPE细胞的特异蛋白。近年来的临床试验表明，iPSCs诱导分化的RPE细胞移植后可改善多数视网膜变性患者的视力。我们先前对4个常染色体显性遗传性RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)家系的研究表明，SNPRNP200 p．S1087L基因突变是这些家系RP的热点致病突变，但是目前尚未发现关于SNPRNP200 p．S1087L基因突变患者建立皮肤成纤维细胞转化iPSCs以及后续的研究报道。本研究中建立SNPRNP200 p．S1087L基因突变患者及正常人的皮肤成纤维细胞向iPSCs转化的方法和正常人iPSCs向RPE细胞分化的方法，为相关疾病的发病机制研究、治疗药物研发及细胞移植疗法奠定基础。
