观察1型糖尿病大鼠视网膜组织内皮黏蛋白(EMCN)表达变化，探讨其通过活化蛋白激酶B(Akt)对1型糖尿病模型大鼠神经元的保护机制。
采用随机数字表法将健康清洁级SD大鼠分为正常对照组、糖尿病模型组、EMCN转染组和mCherry转染组4个组，每组14只，造模前2周玻璃体腔内注射生理盐水、腺相关病毒(AAV)、AAV-EMCN或AAV-mCherry，分别收集造模后4周和8周视网膜组织蛋白样本。采用Western blot法检测各组大鼠EMCN的表达；利用视网膜铺片观察AAV对造模后8周大鼠视网膜的转染效率；采用苏木精－伊红染色观察造模后8周各组大鼠视网膜组织形态结构变化；采用免疫荧光染色检测造模后8周各组大鼠视网膜组织细胞中cleaved caspase-3阳性细胞情况；采用TUNEL法观察各组大鼠造模后8周视网膜组织凋亡细胞情况；采用Western blot法检测造模后8周各组大鼠视网膜组织中Akt磷酸化比例。
糖尿病模型组、EMCN转染组和mCherry转染组大鼠空腹血糖(FPG)均较对应时间点正常对照组高，差异均有统计学意义(均P<0.001)。糖尿病模型组大鼠造模后4周、8周视网膜组织中EMCN表达量均低于正常对照组，差异均有统计学意义(t＝3.71，P<0.05；t＝10.09，P<0.001)。造模后8周，mCherry转染组大鼠视网膜铺片间可见大量红色荧光，表明AAV转染视网膜细胞成功。糖尿病模型组大鼠视网膜组织中EMCN蛋白相对表达量较正常对照组显著下降，差异有统计学意义(t＝13.67，P<0.001)，EMCN转染组大鼠视网膜组织中EMCN表达量较糖尿病模型组增加，差异有统计学意义(t＝3.18，P<0.05)，mCherry转染组视网膜组织中EMCN表达水平与糖尿病模型组比较，差异无统计学意义(t＝2.31，P＝0.08)。正常对照组大鼠视网膜组织结构正常，糖尿病模型组及mCherry转染组大鼠视网膜组织内界膜肿胀，视网膜神经节细胞(RGCs)减少，内核层及外核层结构疏松排列紊乱，EMCN转染组视网膜内界膜稍增厚，内核层和外核层排列稍紊乱。糖尿病模型组和mCherry转染组大鼠视网膜cleaved caspase-3阳性细胞和凋亡细胞较正常对照组明显增加，EMCN转染组大鼠视网膜组织中cleaved caspase-3阳性细胞和凋亡细胞较正常对照组略增加，较糖尿病模型组明显减少。糖尿病模型组大鼠视网膜组织中p-Akt/Akt表达量较正常对照组显著下调，差异有统计学意义(t＝5.52，P<0.01)，EMCN转染组大鼠视网膜组织中p-Akt/Akt表达量较糖尿病模型组明显增加，差异有统计学意义(t＝3.14，P<0.05)，mCherry转染组视网膜组织中p-Akt/Akt表达量与糖尿病模型组比较，差异无统计学意义(t＝0.81，P＝0.46)。
过表达EMCN可以减轻糖尿病大鼠视网膜神经元凋亡，其机制可能与活化Akt信号通路相关。
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糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)被认为是视力损害和致盲的主要原因之一，2010年全球因DR致盲的人数约为80万，因DR受到视力损害的人数约为370万[1]。DR的病理改变包括血管通透性增加、血－视网膜屏障破坏、视网膜细胞凋亡、微血管瘤及无细胞毛细血管形成[2]。越来越多的研究表明，视网膜神经元的损害可能先于血管损伤[3]。神经元包括视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)、无长突细胞和光感受器细胞，这些细胞在糖尿病状态下均会受到损害并最终导致视力的损害[4,5]。血管系统和神经系统是视网膜组织的重要组成部分，其中视网膜神经元、胶质细胞、微血管、细胞外基质可构成视网膜神经血管单元(neurovascular unit，NVU)[6]。NVU各细胞间的信号正常传递是保证神经元和微血管功能及稳态的物质基础，细胞间可传递多种信号分子，如多种蛋白、神经递质、离子等[7]。DR的发生和发展也与视网膜NVU功能和结构的失调密不可分，例如糖尿病状态下微血管内炎性细胞和蛋白传递至神经元，从而导致其凋亡[8,9]。内皮黏蛋白(endomucin，EMCN)是高度O-糖基化的I型跨膜糖蛋白，且特异性地分布于静脉和毛细血管内皮细胞[10,11]。EMCN蛋白结构包括磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)家族ras结合域、蛋白酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶磷酸化位点[12]。PI3K/Akt信号通路参与细胞代谢、存活、分化和增生等过程，并且是神经细胞的经典存活通路，病理状态下该通路被抑制后可活化凋亡级联反应的关键分子——caspase-3，导致神经细胞的凋亡[13,14]。通过激活PI3K/Akt通路可对多种引起神经细胞凋亡的疾病发挥保护作用，如阿尔兹海默症和DR等[15,16,17]。过表达EMCN是否可使其PI3K家族与ras结合，进而激活Akt尚未有报道。本研究拟观察DR发病过程中EMCN的表达情况，并通过过表达EMCN观察其对Akt及caspase-3活化的影响和对神经元凋亡的影响。
