成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR associated proteins，Cas)系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。随着技术的不断进展，研究者发现CRISPR/Cas9技术可用于靶向插入、替换或敲除真核细胞基因。研究者运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，发现了PAX6在角膜中的过度表达可导致先天性角膜上皮损伤，进一步加深了关于KRT12突变对Meesmann角膜上皮营养不良的致病机制的研究。研究还发现PAX6可通过对GJA8基因以及αA晶状体基因的敲除来进行先天性白内障动物模型的构建，有利于未来应用于先天性白内障的鉴别和病理分析。此外，研究者应用CRISPR/Cas9基因组编辑技术进一步证实了RHOS334基因突变的RHO等位基因、P23H突变的RHO基因、Y347X突变的Pde6b基因以及突变型RP9等位基因与视网膜色素变性的相关性，为突变型KCNJ13基因、突变型CEP290基因与Leber先天性黑矇的相关性提供了证据支持。利用该技术对VEGFR2基因以及TXNIP基因进行基因编辑可为眼内新生血管疾病提供新的治疗靶点，同时该技术在增生性玻璃体视网膜病变以及视网膜母细胞瘤的致病基因研究和动物模型构建中也发挥了重要的作用。本文对CRISPR/Cas9基因组编辑工具酶的发展历程、分子特点和作用机制进行总结，并概述了当前CRISPR/Cas9技术在眼科疾病研究中的进展及应用。
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成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关蛋白系统(CRISPR associated proteins，Cas)广泛分布于细菌和古生菌基因组中，是在进化过程中形成的一种适应性免疫系统，可以降解入侵病毒或质粒DNA[1]。近年来，CRISPR/Cas系统已发展成为包括眼科疾病在内的许多医学领域中的新型基因编辑工具，拥有精确的靶向功能，可通过靶向修饰来创建生物模型，并能以治疗为目的矫正疾病的突变[2]。1987年，CRISPR被Ishino等[3]报道为一组位于大肠杆菌中的iap基因下游的重复序列－间隔序列－重复序列的结构。之后，研究者们又在细菌和古细菌中，发现了CRISPR的间隔序列与噬菌体基因组和质粒高度同源，猜想CRISPR作为一种免疫系统可保护细菌和古细菌免受外源噬菌体、质粒或病毒的侵入[4]。Barrangou等[5]通过将嗜热链球菌与不同的噬菌体共培养从而筛选具有噬菌体抗性的菌株，在DNA测序中发现了CRISPR座位中有了新的间序列，而此间隔序列正是来自侵染的噬菌体，并且证实了CRISPR和其相关的cas基因赋予了细菌对噬菌体的抗性。在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，其中CRISPR/Cas9是研究最深入，应用最成熟的一种类别。CRISPR/Cas9基因编辑技术是由细菌和古细菌中存在的Ⅱ型CRISPR/Cas获得性免疫系统经人工改造而成，其介导的细菌获得性免疫具体机制的如下：当外源噬菌体或质粒进入细菌后，细菌通过识别特异的原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，将外源DNA加工成大小合适的间隔序列，插入到CRISPR序列中。CRISPR位点转录、表达pre-crRNA，与重复序列区域转录而成的反式激活RNA(tans-activating crRNA，tracrRNA)配对，在CnsⅠ和RNase Ⅲ作用下形成成熟的crRNA，在Ⅱ型CRISPR/Cas系统中，tracrRNA和crRNA作为2种向导RNA(guide RNA，gRNA)或者融合在一起形成单向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)，可以与核酸内切酶Cas9结合，形成核糖核蛋白体复合物，引导Cas9蛋白特异性识别并结合到靶DNA序列上进行切割。Cas9蛋白的核酸酶区域包含HNH核酸酶和RuvC样核酸酶结构域，分别切割互补和不互补的目标DNA链。Cas9识别目标基因中的PAM序列，crRNA识别位于PAM 5’端互补的20 bp DNA序列，继而稳定Cas9和基因组的结合，更易于靶位点的切割及基因组产生位点特异性双链断裂(site-specific double-strand breaks，DSB)[6]，进利用细胞内原有的DNA修复途径，如非同源末端连接接(nonhomologous end-joining，NHEJ)、同源定向修复(Homology directed repair，HDR)等，引入、替换或删除靶基因[7]，对DNA进行遗传学修饰。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第3代基因组编辑技术。与ZFN和TALEN技术相比，该技术不仅在设计、合成与筛选上更为简便、快捷，而且可以在1个细胞内同时靶向定位多个基因位点进行编辑，成倍的提高了基因编辑的效率，且更适用于多基因编辑[8]。由于CRISPR/Cas9基因编辑技术的制备简单、成本低廉、作用高效且无种属限制等特点，较ZFN和TALEN表现出明显的优势，故从诞生之日起，它就成为了众多科研工作者关注的宠儿并获得了快速发展。但是Cas蛋白的不稳定性和脱靶效应又在一定程度上限制了其应用的范围[9]。
