探讨人胚胎干细胞(hESC)定向分化为晶状体小体(LB)过程中晶状体发育相关转录因子的表达特点和规律。
通过"三阶段法"体外诱导hESC定向分化为LB。取hESC(D0)和诱导分化不同时间点的细胞，应用高通量测序技术，通过生物信息学方法分析晶状体发育相关的转录因子及其亚型的表达变化特点和规律。采用Western blot法和免疫荧光染色技术对相关基因在蛋白水平的表达进行检测。
光学显微镜下，未分化的hESC呈圆形；分化后0～6 d(D0～D6)的细胞更圆且排列更紧密；D7～D18细胞由圆形逐渐延长变为梭形；D19～D32，形成有三维立体结构的透明结构，即LB。荧光定量PCR结果显示，干细胞标记基因的表达在分化过程显著降低，而晶状体特异性基因的表达明显升高。免疫荧光染色结果显示，LB表达晶状体特异性蛋白α-crystallin和β-crystallin。高通量测序聚类分析结果显示，D0与D32之间的转录因子基因表达谱差异最为显著，而D6和D18之间的差异最小。前基板基因DLX3、DLX5、DLX6、HES1、HES4、OTX2和EYA1在分化第一阶段表达显著升高，随后下降；晶状体特异性基因中SOX2蛋白表达逐渐降低，而后升高，而PAX6蛋白的表达随分化时间延长逐渐增加；晶状体分化基因MAB21L1、CMAF、PROX1及PITX3等在分化早期变化不显著，在分化第三阶段表达明显增加。
体外定向分化的3个阶段依次对应体内晶状体发育的前基板外胚层(PPE)阶段、前晶状体外胚层(PLE)和晶状体外胚层(LE)阶段、晶状体泡(LV)和晶状体细胞分化阶段，提示hESC体外定向分化过程很好地模拟了体内晶状体的胚胎发育过程，为研究晶状体发育和先天性晶状体疾病的分子机制提供了理想的模型。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
多种转录因子共同作用可调控晶状体的胚胎发育过程，包括神经和非神经外胚层的形成以及晶状体基板(lens placode，LP)、晶状体泡(lens vesicle，LV)以及晶状体上皮和纤维细胞的分化[1]。人晶状体发育过程中转录因子的基因突变会引起多种眼部疾病。已有研究表明，转录因子基因MAF、FOXE3和PROX1的突变会引起白内障、无晶状体、小眼畸形和角膜后胚胎环等先天性疾病[2,3,4]。晶状体发育相关转录因子分为前基板基因、晶状体特异性基因和晶状体分化基因[5]，探讨各转录因子在晶状体发育过程中的表达和功能对于了解晶状体发育和晶状体相关疾病的发生机制至关重要。近年来，人胚胎干细胞研究(human embryonic stem cells，hESCs)为组织器官的发育和机制的研究提供了良好的工具。目前已有研究成功地将hESCs和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)诱导为表达晶状体标志物α-crystallin、β-crystallin和phakinin的晶状体小体(lentoid body，LB)[6,7,8]，这为体外研究晶状体的发育提供了有用的模型。但是，体外定向分化体系中晶状体发育相关转录因子的变化特点与体内晶状体胚胎发育的过程是否符合尚不明确。本研究中拟采用高通量测序技术检测hESCs定向分化为LB过程中晶状体发育相关转录因子的表达特点和规律，并探索hESC体外定向分化过程是否很好地模拟了体内晶状体的胚胎发育过程。
