构建和鉴定慢病毒介导的小鼠线粒体靶向8-羟基脱氧鸟嘌呤DNA糖苷酶1(mito-OGG1)基因在661W细胞中的过表达，以及慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)下调OGG1基因在661W细胞中的表达。
构建目的质粒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Mito-OGG1-3Flag(pLenti-OGG1-GFP)和pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA(pLKD-shRNA)，利用第2代慢病毒包装系统和293T细胞获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的目的慢病毒载体，利用293T细胞进行病毒滴度检测，荧光显微镜计数法检测不同感染复数(MOI)梯度下661W细胞的转染效率和生存情况，并确定最适MOI，利用不同浓度梯度嘌呤霉素作用于661W细胞以筛选出嘌呤霉素最低使用浓度，并以此浓度筛选出稳定转染细胞株，免疫荧光检测筛选后细胞转染效率并进行细胞色素C氧化酶Ⅳ(COXⅣ)-OGG1共定位鉴定，采用荧光定量PCR(QPCR)和Western blot法分别检测OGG1基因的mRNA和蛋白相对表达水平。
测序结果显示，过表达质粒中插入的序列与基因库中小鼠OGG1(NM_010957.4)基因序列一致，包装纯化后的慢病毒原液滴度为2.0×107～6.0×107 TU/ml，661W细胞最适MOI为40，4.0 μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳转株，筛选后转染效率达100%。免疫荧光染色结果显示，OGG1与COXⅣ成功共定位。空白对照组、OGG1组、过表达对照组、shRNA组和低表达对照组OGG1 mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、41.581±12.206、0.888±0.056、0.239±0.121和1.081±0.083，OGG1蛋白的相对表达量分别为1.029±0.153、1.657±0.237、0.752±0.143、0.471±0.149和1.036±0.185，各组间总体比较差异均有统计学意义(F＝44.654、30.948，均P<0.05)，其中OGG1组的OGG1 mRNA和蛋白相对表达量均较过表达对照组明显升高，shRNA组的OGG1 mRNA和蛋白相对表达水平均较低表达对照组明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
本实验成功构建661W细胞mito-OGG1过表达和OGG1敲减模型，为下一步研究提供了实验基础。
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8-羟基脱氧鸟嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA-glycosylase 1，OGG1)能够特异性地识别和切除8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxy-deoxyguanosine，8-OHdG)，存在于细胞核和线粒体中，是碱基切除修复途径的关键酶之一[1]。研究表明，线粒体靶向OGG1(mitochondrial-targeted-OGG1，mito-OGG1)在细胞中过表达可减少由氧化应激诱导的8-OHdG形成，促使线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)含量增加，提高线粒体功能[2,3,4,5]。而OGG1被敲除之后的小鼠可迅速发展肿瘤，如肺癌、肠癌、卵巢肿瘤等，生存率较正常小鼠显著降低[6]；同时DNA修复关键酶OGG1的缺乏也阻碍了脑卒中的恢复，且与中风后神经功能恶化相关[7]。目前许多研究利用各种病毒载体技术进行基础实验或动物研究，有可能成为今后临床治疗的一种有效方法。相对于腺病毒和逆转录病毒，慢病毒具有感染能力强、整合外源基因、目的基因表达持续等优点，更适合应用于细胞实验等体外研究[8]。本研究中将构建重组慢病毒载体，并感染661W感光细胞株，观察慢病毒目的载体是否能够成功转染661W细胞，探究合适的转染条件，并在mRNA水平和蛋白水平上进行验证，为进一步探讨OGG1对661W细胞抗氧化能力的影响与机制提供一定的实验基础。
