观察氯离子通道阻滞剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的体外培养人结膜成纤维细胞(HConF)纤维化中的作用，并进一步探索其作用机制。
采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法筛选出TGF-β1最适作用时间和NPPB最适作用浓度，将细胞分为对照组、TGF-β1处理组和TGF-β1＋NPPB组，CCK-8法检测各组HConF细胞增生值(A)，采用流式细胞仪检测各组HConF细胞周期，通过细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测各组细胞迁移情况。采用Western blot和荧光定量PCR法检测HConF细胞向肌成纤维细胞转化的标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)和纤维连接蛋白(FN)的表达，同时用Western blot法检测PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平。
TGF-β1可促进细胞增生，并呈时间依赖性；其中TGF-β1作用后48 h和72 h细胞A值比较，差异无统计学意义(P＝0.064)，选择48 h作为TGF-β1作用的最适时间。NPPB抑制HConF细胞增生作用呈浓度依赖性；与对照组比较，50 μmol/L和100 μmol/L NPPB组细胞增生值明显降低，差异均有统计学意义(P＝0.020、0.000)，选择100 μmol/L作为NPPB的最适作用浓度。TGF-β1＋NPPB组细胞A值、相对迁移面积和迁移细胞数较TGF-β1处理组下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)；TGF-β1处理组G1期细胞比例较对照组和TGF-β1＋NPPB组明显减少，S期和G2/M期细胞比例增多，差异均有统计学意义(均P<0.05)。TGF-β1处理组α-SMA、细胞外基质COL-Ⅰ和FN的蛋白及mRNA相对表达量均明显高于对照组和TGF-β1＋NPPB组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；TGF-β1处理组p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值明显高于对照组和TGF-β1＋NPPB组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
NPPB可能通过抑制PI3K和Akt磷酸化来抑制TGF-β1诱导的HConF增生、迁移、分化及细胞外基质合成等纤维化过程。
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青光眼是以视神经损害和进行性视野缺损为特征的一类进展性视神经病变[1]。滤过性手术是治疗青光眼的主要手术方法，但其成功率受滤过泡瘢痕化等因素的影响[2]。目前，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)和丝裂霉素C(mitomycin C，MMC)等抗代谢药物常被用于抑制滤过性手术后滤过泡瘢痕的形成，以提高手术成功率[3]；但是药物的细胞毒性作用常引起各种严重的并发症[4]。因此，寻找抗滤过泡纤维化的新靶点具有重大意义。研究表明，CLC氯离子通道在多种细胞增生、分化、凋亡、迁移方面起调节作用[5,6,7]。我们前期的研究也发现，CLC-2氯离子通道参与调控结膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、细胞周期、增生、迁移及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成这一系列纤维化过程[8]。5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸[5-Nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid，NPPB]是一种非特异性氯离子通道阻滞剂，通过改变氯离子通道蛋白的构象而阻断CLC-2、CLC-3等氯离子通道，从而抑制其功能[6]。NPPB是否对人结膜成纤维细胞(human conjunctival fibroblasts，HConF)纤维化有抑制作用，目前尚不明确。本研究通过转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)诱导人HConF纤维化，观察NPPB对HConF细胞分化、增生、迁移及ECM形成过程的抑制作用及其信号传导通路，以期为抗青光眼滤过泡瘢痕化提供一种新的思路和药物靶点。
