探究昼夜节律颠倒对角膜上皮创伤修复的影响。
选取6～8周龄C57BL/6雄性小鼠90只，按照随机数字表法分为昼夜节律正常(LD)组和昼夜节律颠倒(DL)组。置于昼夜节律箱中饲养12 d，在小鼠角膜中央标记直径为2 mm的圆形区域，用高尔夫样刀刮除标记区域上皮层，分别使用荧光素钠、苏木精－伊红染色观察并记录角膜再上皮化过程。使用DAPI、FITC标记抗鼠Ly6G抗体和PE标记抗鼠γδTCR抗体进行免疫荧光染色，每隔6 h观察角膜创伤后细胞分裂、中性粒细胞和γδT细胞数量的动态变化，直至42 h。
角膜上皮创伤后0、6、12、18和24 h LD组角膜上皮缺损面积百分比分别为(100.000±0.000)%、(37.677±5.243)%、(14.959±1.739)%和(0.000±0.000)%，DL组角膜上皮缺损面积百分比分别为(100.000±0.000)%、(10.967±1.065)%、(1.985±0.106)%和(0.000±0.000)%，总体比较差异有统计学意义(F＝213.718，P＝0.000)。角膜上皮创伤前，DL组和LD组角膜上皮层厚度分别为(33.983±1.074)μm和(33.993±0.904)μm，差异无统计学意义(P>0.05)；角膜上皮损伤后24 h，DL组角膜上皮厚度为(19.473±0.856)μm，明显大于LD组(17.485±0.718)μm，差异有统计学意义(P<0.05)。苏木精－伊红染色显示，创伤24 h后2个组小鼠角膜上皮细胞皆排列疏松、紊乱、形态不规则。LD组角膜上皮主要为基底细胞，DL组除了基底细胞外，还有少量扁平细胞。角膜上皮创伤后LD组和DL组上皮分裂细胞数量、中性粒细胞数量和γδT细胞数量总体比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。
昼夜节律颠倒可通过促进角膜上皮分裂细胞、中性粒细胞和γδT细胞募集高峰期提前，进而调节角膜上皮创伤修复过程。
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角膜位于眼球前部，呈透明横椭圆形，提供大部分屈光力。角膜必须不断更新上皮细胞层，以此维持角膜上皮的稳态，保持光滑的光学表面。角膜上皮更新通过细胞增生、迁移、分化、分层和凋亡等来实现，这一过程损伤会打破角膜上皮的动态平衡，导致角膜上皮缺损[1]。角膜损伤修复过程包括再上皮化、细胞增生、炎症反应和细胞外基质重塑4个阶段。角膜上皮损伤的修复是眼球功能正常的保证，因此探究角膜损伤修复的机制异常重要。昼夜节律存在于生物体中，也存在于器官，甚至细胞中。激素分泌、新陈代谢、细胞周期和睡眠/觉醒周期受昼夜节律调控[2]。昼夜节律的维持受外部环境影响，其中光照/黑暗循环影响最大[3]。角膜是视觉系统感受外界光线刺激过程中重要的屈光装置之一。视网膜昼夜节律钟是哺乳动物中发现的首个超视交叉上核昼夜节律振荡器[4]。眼轴长度、脉络膜厚度、眼压、视盘、角膜厚度及角膜上皮层厚度变化均存在昼夜节律[5,6,7]。光照节律能改变大鼠视网膜中时钟基因的表达[8]。角膜具有生物钟功能，昼夜节律能控制角膜厚度且对角膜的正常生长发育有重要作用[9]。角膜上皮更新有日节律性[10]。角膜上皮损伤后，角膜缘血管发生急性炎症反应，中性粒细胞通过细胞表面整合素被损伤部位的趋化因子吸引迅速向创伤区聚集以杀灭病原体和清除坏死组织[11]。大多数免疫细胞表达昼夜节律时钟基因，时钟基因作用包括影响细胞因子、趋化因子和溶细胞因子的合成与释放和控制免疫细胞向炎症或感染组织中迁移的速度，影响损伤组织愈合[12]。中性粒细胞的募集和存活受昼夜节律严格控制[13]。在不同时间点给予小鼠内毒素(脂多糖)雾化吸入，肺脏中性粒细胞聚集数量及高峰期不同[14]。角膜γδT细胞对角膜损伤后修复有调节作用。γδT细胞在上皮层聚集有助于角膜创伤修复，而在γδT细胞缺陷小鼠模型中角膜上皮的创伤修复显著延迟[15]。猪血中γδT细胞存在昼夜节律且黑暗时段数量最多[16]。昼夜节律改变，会导致免疫紊乱[12]。基因突变或环境因素导致的昼夜节律失调会导致多种疾病[17]。持续光照或持续黑暗会延迟角膜再上皮化并加剧炎症反应，抑制角膜修复[18]。目前，昼夜节律颠倒对角膜创伤修复的影响鲜有报道。本研究中建立昼夜节律正常(12 h light/12 h dark，LD)/昼夜节律颠倒(12 h dark/12 h dark，DL)小鼠角膜创伤修复模型，研究昼夜节律颠倒对角膜修复的影响，为角膜损伤的临床实践提供新的思路。
