利用定量蛋白组学技术探索高糖状态下人视网膜微血管周细胞(HRMPCs)的蛋白表达变化,为糖尿病视网膜病变(DR)早期周细胞缺失的机制研究提供新的蛋白靶点。
将HRMPCs分为对照组和高糖组,分别用葡萄糖浓度为25 mmol/L和35 mmol/L的DMEM培养基培养48 h,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定各组HRMPCs活性。提取各组细胞的蛋白并进行酶切,得到肽段,取2 μg肽段进行飞行时间质谱(TOF-MS)检测,质谱的采集模式为数据依赖性(DDA),对得到的蛋白表达信息进行生物信息学分析。
高糖组的HRMPCs数量较对照组明显减少,且高糖组的部分细胞出现体积变小、变形等改变。CCK-8实验结果显示,高糖组HRMPCs吸光度(A450)值为0.75±0.04,明显低于对照组的0.91±0.05,差异有统计学意义(t=5.784,P=0.000 2)。本研究共鉴定到1 972个可定量蛋白,其中差异蛋白有54个(差异倍数>1.5)。相比于对照组,高糖组细胞中上调的差异蛋白有13个,包括CTNNB1、CTBP2等,下调的差异蛋白有41个,包括SQSTM1、HMGCS1等。这些差异蛋白主要参与了三羧酸循环、有氧呼吸等生物学过程。
高糖刺激HRMPCs会改变多种蛋白的表达,进而影响细胞的呼吸作用和ATP的生成,最终导致周细胞的缺失。
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糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)作为工作年龄人群致盲的首要原因,已受到广泛关注。根据病变的严重程度,DR可分为非增生性糖尿病视网膜病变(nonproliferative DR,NPDR)和增生性糖尿病视网膜病变(proliferative DR,PDR)。目前针对DR的治疗手段主要有全视网膜光凝(pan retinal photocoagulation,PRP)、抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)眼内注射和玻璃体切割手术,但各种方法存在一定的局限性,并且都无法真正控制DR的进展。因此眼科医生们也一直在探寻治疗DR的新方法,比如间充质干细胞治疗[1,2]。DR的治疗重在早期干预,如果能在DR早期控制其病理发展,将明显改善患者预后,因此对DR早期的发病机制研究具有重要的意义。DR的特征性病变包括基底膜增厚、内皮细胞紧密连接减弱、周细胞的缺失、血管通透性增加和微动脉瘤等,其中视网膜微血管周细胞在DR早期疾病进展的控制中发挥着重要作用,其缺失使其对内皮细胞的增生控制减弱,容易产生新生血管[3]。有研究表明高糖导致周细胞的缺失与GAPDH/Siah1凋亡通路的激活有关[4],另有研究表明色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)可以通过谷胱甘肽过氧化物酶途径发挥抗氧化作用,从而抑制高糖或H2O2导致的周细胞凋亡及功能缺失。然而,对DR中周细胞缺失的原因仍然缺乏系统性研究。蛋白组是由有机体产生或修饰的整套蛋白质,并且会随时间或有机体状态的不同而发生改变[5]。近年来,液相串联质谱仪已成为蛋白组学研究领域的重要工具,其具有高灵敏度、高分辨率、高通量的特点,能够对研究对象的蛋白表达进行大规模的定量或定性分析。因此本研究中利用液相串联质谱仪定量分析高糖环境下人视网膜微血管周细胞(human retinal microvascular pericytes,HRMPCs)的蛋白表达,筛选差异蛋白,为DR基础研究或临床治疗提供理论依据。