探讨Hedgehog蛋白对血－视网膜内屏障中人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)功能的影响及其可能的信号通路。
取在正常培养基中培养的HRMEC，分为正常对照组、0.5 μmol/L激动剂组和1.0 μmol/L激动剂组，分别加入终浓度为0、0.5和1.0 μmol/L的Hedgehog激动剂purmorphamine；取高糖培养基中培养的HRMEC，分为高糖对照组、1.5 μmol/L抑制剂组和2.5 μmol/L抑制剂组，分别加入终浓度为0、1.5和2.5 μmol/L的Smoothed抑制剂Erismodegib。采用MTS细胞增生实验和Transwell细胞迁移试验检测各组HRMEC增生A490值和相对迁移率。采用Western blot方法检测各组细胞鸟苷酸结合蛋白偶联受体(GPCRs)通路下游PLCγ1、Akt和Erk蛋白磷酸化水平变化。
高糖对照组细胞Hedgehog蛋白相对表达量为6.24±0.11，明显高于正常对照组的1.00±0.00，差异有统计学意义(t＝667.573，P<0.001)。0.5 μmol/L激动剂组和1.0 μmol/L激动剂组A490值分别为1.349±0.050和1.422±0.053，相对迁移率分别为2.34±0.14和3.59±0.32，明显高于正常对照组的1.203±0.101和1.00±0.00，差异均有统计学意义(均P<0.01)。1.5 μmol/L抑制剂组和2.5 μmol/L抑制剂组细胞A490值分别为0.849±0.010和0.737±0.030，相对迁移率分别为0.43±0.02和0.27±0.01，明显低于高糖对照组的1.000±0.040和1.00±0.00，差异均有统计学意义(均P<0.01)。0.5 μmol/L激动剂组和1.0 μmol/L激动剂组PLCγ1磷酸化比值、Akt磷酸化比值和Erk磷酸化比值均明显高于正常对照组，1.5 μmol/L抑制剂组和2.5 μmol/L抑制剂组PLCγ1磷酸化比值、Akt磷酸化比值和Erk磷酸化比值均明显低于高糖对照组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。
高糖诱导HRMEC中Hedgehog蛋白表达，Hedgehog蛋白可能通过调节GPCRs通路中PLCγ1、Akt和Erk磷酸化水平来调节HRMEC的功能。
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糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是中国50岁以上糖尿病患者主要的致盲原因，其在糖尿病患者人群中的患病率为24.7%～35.7%，其中增生期DR占3.3%～7.4%[1]。DR早期病理改变为血－视网膜屏障的破坏，尤其是内屏障。内屏障由视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cell，HRMEC)及其间闭合小带和周细胞构成。屏障功能破坏可导致细胞增生迁移能力的改变，造成渗出、出血等严重的病理改变。Hedgehog蛋白是一种调控胚胎发育和组织形成的蛋白，其信号通路的激活与肿瘤发生有关，属于异常增生现象，而视网膜新生血管形成也属于血管的异常增生。目前研究证实，多种细胞、细胞因子通过对胰岛素抵抗、葡萄糖代谢、氧化应激、炎症及生长因子等的影响促进DR的发生和发展[2]，但DR发生和发展的机制尚未完全阐明，治疗方法也在不断探索。目前已有关于Hedgehog蛋白与内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)、角膜新生血管、脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)、DR等的研究，表明Hedgehog蛋白能够促进EPC的发育及角膜和CNV的形成[3,4,5,6,7]。然而，Hedgehog蛋白影响DR发生和发展的作用机制尚未完全明确。进一步阐明DR的发病机制并对其进行早期诊疗是目前的研究重点。本研究中检测Hedgehog蛋白激动剂及Smoothed抑制剂对HRMEC增生和迁移能力以及鸟苷酸结合蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)通路下游PLCγ1、Akt和Erk蛋白磷酸化表达的影响，探讨Hedgehog蛋白对HRMEC功能的影响及其可能的信号通路机制。
