研究驻景丸加减方含药血清对过氧化氢(H2O2)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE)-19细胞上皮－间质转化(EMT)的作用及其机制。
选取2月龄SPF级雌性SD大鼠30只，采用随机数字表法将其随机分为空白对照组和驻景丸加减方组，每组15只，分别给予生理盐水和驻景丸加减方连续灌胃7 d，以制备空白血清和含药血清。采用SD大鼠制备驻景丸加减方含药血清。将ARPE-19细胞分为正常对照组，模型对照组，空白血清组，2.5%、5.0%、10.0%含药血清组，SB216763组和SB216763+含药血清组；其中前2个组均于正常培养基中培养，后6个组分别于含空白大鼠血清培养基、相应浓度含药血清培养基、10 μmol/L GSK-3抑制剂SB216763培养基以及10 μmol/L SB216763+10.0%的含药血清培养基中培养；正常对照组常规培养，其他各组先常规培养24 h，后加入终浓度200 μmol/L的H2O2继续培养24 h。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞活性；Transwell法检测细胞迁移能力；DCFH-DA法检测细胞内活性氧簇(ROS)含量；硫化巴比妥酸法检测细胞内丙二醛(MDA)含量；Western blot法检测细胞中Nrf2通路相关蛋白核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO-1)和EMT相关蛋白转化生长因子β2(TGF-β2)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、snail家族锌指转录因子1(SNAIL1)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。
空白血清组、2.5%、5.0%、10.0%组细胞存活率总体比较差异无统计学意义(F＝0.163，P>0.05)。正常对照组、模型对照组、2.5%含药血清组、5.0%含药血清组、10.0%含药血清组细胞存活率分别为(100.50±5.91)%、(60.87±4.30)%、(73.27±4.46)%、(80.73±5.67)%和(89.90±4.97)%，正常对照组、模型对照组、空白血清组、2.5%含药血清组、5.0%含药血清组和10.0%含药血清组细胞迁移数分别为(84.67±8.33)、(222.33±13.58)、(215.67±10.02)、(174.67±10.60)、(143.67±8.02)和(107.67±6.66)个/视野，总体比较差异均有统计学意义(F＝26.628、99.289，均P<0.01)。模型对照组细胞内ROS和MDA含量较正常对照组显著增加，差异均有统计学意义(均P<0.01)；各含药血清组细胞内ROS和MDA含量均较模型对照组显著减少，差异均有统计学意义(均P<0.01)。模型对照组细胞内SNAIL1、α-SMA、TGF-β2、p-AKT及p-GSK-3β蛋白相对表达量明显多于正常对照组和各浓度含药血清组，E-cadherin蛋白相对表达量明显少于正常对照组和各浓度含药血清组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与正常对照组比，模型对照组细胞质Nrf2蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与模型对照组比，各含药血清组细胞质Nrf2蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均P<0.01)。与模型对照组相比，SB216763组细胞质Nrf2蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与SB216763组相比，SB216763+含药血清组细胞质Nrf2、SNAIL1和α-SMA蛋白相对表达量降低，细胞核Nrf2和E-cadherin蛋白相对表达量升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
驻景丸加减方含药血清抑制H2O2诱导的ARPE-19细胞EMT，可能与AKT/GSK-3β通路的抑制及Nrf2信号通路的激活有关。
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视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞维持光感受器结构和功能的完整，RPE细胞的损害是多种视网膜脉络膜疾病的重要原因，如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)等。RPE细胞可被各种生长因子和细胞因子激活，发生上皮－间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，使去分化的上皮细胞移行、增生并转化为成纤维细胞。研究表明，核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路和EMT均与AMD发病密切相关。氧化应激是RPE细胞功能损害的关键因素，诱导活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增加；Nrf2通路作为人体最重要的抗氧化通路，通过平衡氧化还原状态维持细胞存活和功能完整。ROS能直接触发转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)介导的EMT，TGF-β又通过NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4，NOX4)进一步促进线粒体生成ROS，形成正反馈回路。在氧化应激状态下，Nrf2通路和EMT之间会发生交互作用，Nrf2可直接抑制snail家族锌指转录因子1(snail family zinc finger 1，SNAIL1)表达从而抑制EMT；TGF-β1诱导的细胞EMT过程中，Nrf2通路的抗氧化作用受到抑制。驻景丸加减方是治疗肝肾亏虚内障眼病的代表方剂，对AMD有一定治疗作用，但其作用机制仍不清楚，这制约了其在临床推广应用，也不利于组方优化和疗效提高。本课题组前期研究显示，驻景丸加减方可激活视网膜组织Nrf2通路，上调下游靶基因血红素氧化酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO-1)表达，对干性AMD模型小鼠视网膜有保护作用。基于此，本研究拟观察驻景丸加减方含药血清对过氧化氢((hydrogen peroxide，H2O2)诱导的ARPE-19细胞EMT的抑制作用，并探讨相关信号通路，以阐明驻景丸加减方治疗AMD的机制，为其临床应用提供理论依据。
