探讨绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人Tenon囊成纤维细胞(HTFs)活化的作用及其可能的作用机制。
收集9例9眼晚期原发性开角型青光眼患者小梁切除术中获取的结膜下Tenon囊组织，通过组织贴壁培养获得原代细胞，采用免疫荧光染色法(波形蛋白+角蛋白)进行细胞鉴定，取4~6代细胞进行后续实验。利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测0~80 μmol/L EGCG干预条件下的细胞存活率。将细胞分为空白对照组、转化生长因子(TGF)-β1诱导组和EGCG干预组，分别于正常培养基、含10 ng/ml TGF-β1培养基以及含10 ng/ml TGF-β1+50 μmol/L EGCG培养基中培养。采用BrdU标记法检测各组细胞增生率，采用细胞划痕实验观察各组细胞迁移情况，采用免疫荧光法检测各组细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，采用Western blot法检测空白对照组、TGF-β1诱导组、10 μmol/L EGCG组和50 μmol/L EGCG组Smad2/3、p-Smad2/3、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)的表达。
体外培养HTFs呈长梭形，生长规律，免疫荧光鉴定波形蛋白呈阳性。CCK-8检测显示，10、20、30、40、50 μmol/L EGCG处理细胞存活率与0 μmol/L EGCG处理细胞比较，差异均无统计学意义(均P<0.05)。BrdU标记实验显示，TGF-β1诱导组细胞增生率为(66.37±12.65)%，高于EGCG组的(14.75±12.33)%，差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验第3天，TGF-β1诱导组相对划痕面积为(47.33±12.22)%，明显低于EGCG干预组的(92.67±4.04)%，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示，TGF-β1诱导组细胞α-SMA蛋白荧光较空白对照组显著增强，EGCG干预组α-SMA蛋白荧光则减弱至空白对照组水平。Western blot法检测结果显示，各组间细胞中p-Smad2/3、PI3K和p-Akt蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F＝58.820、121.153、69.289，均P<0.001)，其中TGF-β1诱导组p-Smad2/3、PI3K和p-Akt蛋白相对表达量明显高于空白对照组、10 μmol/L和50 μmol/L EGCG组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。
EGCG能够通过Smad通路及PI3K/Akt信号通路抑制TGF-β1诱导的HTFs活化。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
青光眼是世界主要的不可逆性致盲眼病，预计2040年全球青光眼患病人数将达到1.2亿。以小梁切除术为代表的滤过手术是青光眼治疗的经典手段，能够使患者眼压长期维持在目标值，延缓视功能的损伤。但是，由于人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts，HTFs)介导的滤过泡瘢痕化，导致长期手术成功率并不理想，即使局部使用抗代谢药物丝裂霉素C或5氟尿嘧啶，小梁切除术后1年失败率仍为9.35%~17.3%。转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)被认为是创伤修复中促使HTFs向具有强收缩性的肌成纤维细胞分化的关键分子。TGF-β1介导的Smad通路是促纤维化的经典途径，也是促使HTFs合成α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，并向肌成纤维细胞转化的主要机制。研究证实，TGF-β1还能够通过激活非Smad依赖性的信号通路发挥促纤维化作用，如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)和Rho等，其中，PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路被证实在滤过泡瘢痕化中发挥着重要作用。因此，寻找安全并且同时对多条促纤维化信号通路均有抑制作用的治疗药物具有重要意义。近年来的细胞和动物相关实验研究发现，绿茶提取物中含量最丰富的表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)在肝脏、肾脏、肺脏等脏器相关的纤维化疾病中发挥着显著的治疗作用。EGCG可通过调控ERK的磷酸化水平而抑制晶状体上皮细胞的增生。但EGCG的功能随着不同的组织或实验模型而改变，甚至有可能出现相反的作用。目前，EGCG对青光眼术后滤过泡瘢痕化的影响尚不清楚。本研究拟分离培养原发性开角型青光眼患者HTFs，探讨EGCG对TGF-β1诱导HTFs纤维化的作用及其机制。
