研究Notch1信号通路抑制剂γ-分泌酶抑制剂(DAPT)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用及其可能机制。
将SPF级出生后第7天(P7)的幼鼠与C57BL/6J母鼠共同饲养于含75%氧气的氧箱中5 d，然后放回正常氧气环境下饲养，以制备OIR模型。采用随机数表法将54只OIR小鼠分为OIR组、OIR+DMSO组和OIR+DAPT组，每组18只，所有小鼠右眼作为实验眼。OIR+DAPT组和OIR+DMSO组在P14小鼠玻璃体腔内分别注射10 mmol/L DAPT和DMSO溶液1 μl，OIR组不予注射。P17时处死各组小鼠，摘出眼球后分离视网膜，采用Western blot法测定Notch1信号通路蛋白及其下游Hes1蛋白、视网膜小胶质细胞M1型标志物诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和M2型标志物精氨酸酶-1(Arg-1)蛋白的相对表达量；制备视网膜铺片，采用同工凝集素(IB4)染色视网膜血管，计算小鼠视网膜新生血管相对面积，定义为新生血管面积/视网膜总面积×100%；采用苏木素－伊红染色法观察突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数量。
OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜中Notch1蛋白相对表达量分别为0.68±0.06、1.00±0.00和1.03±0.08，Hes1蛋白相对表达量分别为0.70±0.08、1.00±0.00和1.02±0.07，组间总体比较差异有统计学意义(F＝70.62、53.65，均P<0.01)。OIR+DAPT组小鼠视网膜中Notch1和Hes1蛋白相对表达量均明显低于OIR组和OIR+DMSO组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜中Arg-1蛋白相对表达量分别为1.49±0.12、1.00±0.00和0.94±0.07，iNOS蛋白相对表达量分别为0.74±0.07、1.00±0.00和1.04±0.10，组间总体比较差异均有统计学意义(F＝89.32、31.63，均P<0.01)，与OIR组和OIR+DMSO组比较，OIR+DAPT组小鼠视网膜中Arg-1蛋白相对表达量明显升高，iNOS蛋白相对表达量明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.01)。OIR+DAPT组、OIR组和OIR+DMSO组小鼠视网膜新生血管相对面积分别为(8.82±2.71)%、(22.32±5.34)%和(20.27±3.36)%，突破内界膜的血管内皮细胞数分别为38.17±3.29、60.83±5.11和58.67±4.75，总体比较差异均有统计学意义(F＝33.72、39.44，均P<0.01)。与OIR组和OIR+DMSO组比较，OIR+DAPT组小鼠视网膜新生血管相对面积缩小，突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数较少，差异均有统计学意义(均P<0.01)。
玻璃体腔注射DAPT可抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成，其作用主要是通过抑制Notch1信号通路活化，进而促使M1型视网膜小胶质细胞向M2型转化来实现。
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视网膜新生血管形成是多种视网膜疾病的并发症，如早产儿视网膜病变、缺血性视网膜静脉阻塞、增生性糖尿病视网膜病变等，可引起视网膜出血、玻璃体积血、黄斑水肿及牵拉性视网膜脱离等，导致严重的视力损害甚至盲[1,2]，目前的主要疗法是抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)药物玻璃体腔注射[3]。但是，抗VEGF药物玻璃体腔注射治疗视网膜新生血管性疾病的主要问题是药物作用持续时间短、新生血管容易复发等，需要反复多次眼内注射，增加了患者的经济负担及眼内感染的风险。此外，还有部分患者对抗VEGF药物治疗应答不良甚至无反应[3,4]，其原因仍不明确。因此，寻找新的治疗靶点和策略对视网膜新生血管形成的防控有着重要的临床意义。视网膜新生血管的形成过程和调控机制十分复杂，各种促进与抑制新生血管生成的细胞因子在新生血管形成的不同阶段发挥协调和平衡作用，精密调控着血管内皮细胞迁移、增生及管腔形成过程[5]。小胶质细胞是视网膜内的固有免疫细胞，在视网膜内微环境稳定及血管结构完整性的维持中发挥着重要作用[6]。研究表明，视网膜小胶质细胞参与生理性和病理性视网膜新生血管的形成过程，大量活化的视网膜小胶质细胞在氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠的视网膜缺血区和新生血管周围呈簇状聚集并呈现明显的增生活性[7]。敲除视网膜小胶质细胞中转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)受体的OIR小鼠视网膜新生血管形成明显增加且消退延迟[8]。对OIR小鼠视网膜新生血管自然病程的研究中发现，小鼠出生后第12天(P12)至P17时视网膜新生血管周围聚集大量的活化小胶质细胞，主要为M1型，P17之后主要为M2型，视网膜新生血管可逐渐自发消退[9]，提示M1型小胶质细胞可能有促进视网膜新生血管形成的作用，而M2型小胶质细胞可能在新生血管的消退中发挥重要作用，但其机制有待进一步研究。小胶质细胞在不同刺激下可迅速活化并表现为不同的极化表型。本课题组前期研究发现，抑制Notch1信号通路可促使活化的M1型视网膜小胶质细胞向M2型转化并可减少炎症因子的释放[10]。目前，OIR小鼠模型广泛用于视网膜新生血管的研究，但是鲜见关于调控小胶质细胞极化在OIR小鼠视网膜新生血管形成中的作用的研究。本研究拟探讨γ-分泌酶抑制剂3，5-二氟苯乙酰基-L-丙氨酰基-L-2-苯基甘氨酸叔丁酯[(3，5-difluorophenylacetyl)-L-alanyl-l-2-phenylglycine tert-butyl ester，DAPT]对OIR小鼠视网膜新生血管形成的抑制作用及其抑制Notch1信号通路后调控视网膜小胶质细胞的极化机制。
