探讨重组人甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)处理的视网膜色素上皮(RPE)细胞中mRNA和N6-甲基腺嘌呤(m6A)改变及其机制。
将传代ARPE-19细胞贴壁培养后分为正常对照组和MeCP2组，正常对照组细胞采用正常培养液培养，MeCP2组细胞于含终质量浓度20 ng/ml重组人MeCP2蛋白培养液中，连续培养72 h。提取细胞内总RNA进行转录组测序(RNA-seq)和甲基化免疫共沉淀测序(MeRIP-seq)分析。采用edgeR软件包根据P<0.05筛选差异表达基因(DEGs)和差异甲基化基因(DMGs)。采用基因本体论(GO)富集分析对差异基因进行生物学功能描述，采用京都基因和基因组百科全书(KEGG)进行通路富集分析。筛选出DEGs与DMGs交集的基因，采用实时荧光定量PCR技术检测各组差异基因mRNA表达水平。
共筛选出DEGs 100个，DMGs 7 441个，富集分析发现DEGs与细胞外基质(ECM)－受体相互作用、细胞分裂、细胞周期和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路等相关，DMGs与微管细胞骨架、血管生成、表皮生长因子受体(ErbB)信号通路、晚期糖基化终末产物(AGEs)－糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路、Notch信号通路和转化生长因子β(TGF-β)信号通路等相关。DEGs中24个基因表达增加，76个基因表达减少；DMGs中5个基因含有高甲基化峰，7 439个基因含有低甲基化峰，注释峰后，正常对照组有7 626个基因发生m6A甲基化，MeCP2组有8 006个基因发生m6A甲基化，2个组间有7 360个交集基因。正常对照组和MeCP2组的m6A甲基化富集于转录本的CDS、内含子和3'-非翻译区(3'UTR)区域，其甲基化比例分别为23.62%/22.27%、48.53%/48.35%和23.66%/25.28%。联合分析发现2个上皮－间充质转化(EMT)相关基因CSPG5和RBP1的mRNA和m6A水平均降低。荧光定量PCR结果显示，MeCP2组GSPG5、RBP1、ZNF484 mRNA相对表达量均明显低于正常对照组，差异均有统计学意义(t＝7.885、7.613、7.345，均P<0.01)。
RPE细胞中MeCP2对EMT的调控机制与m6A甲基化修饰相关。CSPG5和RBP1基因可能是m6A甲基化的靶基因，参与MeCP2调控的EMT过程。
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增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是复发性视网膜脱离的重要原因，发病机制复杂，病理变化多样。目前，玻璃体切割术是PVR的主要治疗方法，但术后仍有复发的可能。PVR的病理特征是细胞增殖并迁移到玻璃体，以及广泛的胶质增生。在与PVR相关的视网膜前膜中已鉴定出多种细胞类型，如视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞、神经胶质细胞和巨噬细胞。RPE细胞的上皮－间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程被认为是PVR发展的关键步骤之一。甲基CpG结合蛋白2(methyl-CpG binding proteins 2，MeCP2)是一种甲基化的DNA结合蛋白，研究发现其异常表达与EMT、纤维化等多种病理状况有关。本课题组之前的研究发现，α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和P-MeCP2-421在人PVR膜上均高表达和双标记；在RPE细胞中敲减MeCP2会抑制转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导的Smad2/3激活、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白(fibronectin，FN)的表达，表明MeCP2在介导RPE细胞EMT/纤维化中发挥关键作用。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)是常见的mRNA内部化学修饰，有研究发现肿瘤细胞EMT过程中，关键转录因子Snail发生m6A修饰。越来越多的研究表明，m6A甲基化修饰参与多种生物过程，如细胞增殖、血管生成、纤维化和炎症反应等。本课题组前期采用m6A甲基化免疫共沉淀测序(methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIP-seq)和转录组测序(RNA sequencing，RNA-seq)分析TGF-β2处理RPE的差异甲基化基因(differentially methylated genes，DMGs)和差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)，进一步的关联分析确定12个差异基因与EMT相关。我们前期通过形态学实验发现重组蛋白MeCP2处理RPE细胞后细胞形态转变为纺锤形或不规则三角形，具有间质细胞特征。但在RPE细胞中m6A修饰与MeCP2的关系尚不完全清楚。本研究采用RNA-seq和MeRIP-seq技术分析MeCP2对RPE细胞mRNA表达和m6A修饰的影响，并探讨m6A甲基化在MeCP2调控RPE细胞EMT中的机制。
