探讨常规体外受精(IVF)失败后6 h和22 h进行挽救性卵胞质内单精子显微注射(ICSI)的效果。
选取2004年6月至2008年11月在本院进行的共31个完全受精失败的IVF周期为研究对象。其中2004年6月至2007年8月共计15个完全受精失败的IVF周期，对所有成熟二级卵母细胞(MⅡ卵子)在受精22 h后进行挽救性ICSI(纳入22 h组)；2007年8月至2008年11月共计16个完全受精失败的IVF周期，对所有MⅡ卵子在受精6 h后进行挽救性ICSI(纳入6 h组)。对两组受精率、卵裂率、胚胎移植(ET)数和临床妊娠率进行比较(本研究遵循的程序符合本院人体试验委员会制定的伦理学标准，征得该委员会批准)。两组患者的年龄、不孕年限等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
6 h组的受精率(77.8%，70/90)显著高于22 h组(47.5%，58/122)，两组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；6 h组的卵裂率(98.6%，69/70)显著高于22 h组(79.3%，46/58)，两组比较，差异亦有统计学意义(P<0.01)；6 h组的临床妊娠率(43.8%，7/16)显著高于22 h组(0, 0/15)，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
常规IVF失败6 h后进行挽救性ICSI可获得更好的受精率、卵裂率和临床妊娠率。
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常规体外受精(in vitro fertilization，IVF)治疗通过在受精后(16～18)h观察受精卵原核形成以判断卵子是否受精。但部分IVF周期由于各种原因会发生完全受精失败，对受精失败卵子进行挽救性卵细胞质内单精子注射技术(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)是惟一的补救方案[1,2,3]。但卵子受精22 h后进行挽救性ICSI的受精率、优质胚胎率和临床妊娠率均较低，极早判断卵子是否受精，并在最短时间内对受精失败卵子进行挽救性ICSI十分重要。90%卵子受精后6 h排出第二极体，受精后8 h所有受精卵均排出第二极体[4]。因此应在受精6 h后对受精失败卵子进行挽救性ICSI可行[5]。从2004年6月至2008年11月本中心共31个完全受精失败的IVF周期，本研究分别于受精后6 h和22 h进行挽救性ICSI，旨在探讨IVF失败后6 h与12 h采取挽救性ICSI的结局。现将研究结果，报告如下。
选取2004年6月至2008年11月共31个于本中心完全受精失败的IVF周期为研究对象。其中2004年6月至2007年8月共计15个完全受精失败的IVF周期，对所有成熟二级卵母细胞(MⅡ卵子)在受精22 h后进行挽救性ICSI，纳入22 h组，其平均年龄为(31.8±3.2)岁，不孕年限为(4.9±3.0)年，均为原发性不孕[输卵管因素为9例，多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)为4例，弱精症为2例]；2007年8月至2008年11月共计16个完全受精失败IVF周期，对所有MⅡ卵子在受精6 h后进行挽救性ICSI，纳入6 h组，其平均年龄为(34.4±2.7)岁，不孕年限为(6.8±3.5)年，均为原发性不孕(输卵管因素为12例，弱精症为3例，卵巢功能减退为1例)(本研究遵循的程序符合本院人体试验委员会制定的伦理学标准，征得该委员会批准，并与受试者签署临床研究知情同意书)。两组患者的年龄、不孕年限等比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
根据患者年龄和卵巢储备功能选取不同的卵巢刺激方案促排卵：①长方案促排卵：在月经周期第21天采用促性腺激素释放激素激动剂(gonadotrophin releasing hormone agonist，GnRHa)进行降调节，月经第3天采用卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)/尿促性素(human menotrophin gonadotropin，HMG)启动。根据患者的年龄，卵巢储备，基础卵泡刺激素(basic－follicle stimulating hormone，B－FSH)，体重指数(body mass index，BMI)，有无手术史等情况，选择不同的启动剂量。FSH/HMG的常规启动剂量为(150～300)IU。当有1个以上卵泡直径≥18 mm、2个以上卵泡直径≥17 mm或3个以上卵泡直径≥16 mm时，于当晚9点肌内注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG) 10 000 IU，36 h后在超声引导下经阴道穿刺卵巢取卵。②拮抗剂促排卵方案：在月经周期第3天采用FSH启动，根据患者年龄、卵巢储备、B－FSH、BMI、有无手术史等具体情况，选择不同的启动剂量，常规启动剂量为(150～300)IU，于主导卵泡直径达到14 mm时，肌内注射用醋酸西曲瑞克(思则凯)0.25 mg×1次/d，最多使用3 d，hCG注射标准及时间同上。
患者于肌内注射hCG 10 000 IU后36 h取卵。经阴道穿刺取出的卵－冠－丘复合物(oocyte corona cumulus complexes, OCCC)在盛有IVF－30的NUNC 4孔培养皿中培养(4～6)h。
精液采用经改良Swim－up法处理，调整精子密度为1.0×106/mL，前向运动精子达98%以上。采用微滴法受精，每个受精滴约含1.0×105条精子，表面覆盖矿物油，在37℃，6%CO2胚胎培养箱中孵育(1～2)h。每个受精滴中加入2～6个OCCC，平均每枚卵子需(2～5)万条精子以完成受精。受精2 h后，将从OCCC上脱落的卵母细胞捞出，在平衡过的IVF－30中剥掉卵子周围的颗粒细胞，冲洗数次，移入胚胎培养微滴。
受精后(16～18)h观察受精卵原核形成情况，对无原核形成和未排出第二极体的卵子，在受精后22 h进行挽救性ICSI(即22 h组)。
受精6 h后，观察剥除颗粒细胞的卵子的极体形态。第二极体的形态为规则的圆形、椭圆形或碎片。有明显2个极体者，认为是有第二极体排出，极体全为碎片或有部分碎片者，视为可疑，可延长观察时间直至原核出现。只有一个极体者，认为无第二极体排出。对未排出第二极体的卵子，在受精6 h后进行挽救性ICSI(即6 h组)。
胚胎移植(embryo transfer, ET)于取卵后第2天或第3天进行。根据患者年龄和移植周期选择≤3个质量最好的胚胎进行ET。根据获卵数目选择不同黄体支持方案，自取卵日开始给予hCG 2000 IU，每3 d肌内注射1次×4次，或肌内注射黄体酮80 mg/d。
嘱患者在ET后第14天进行晨尿hCG或血β－hCG滴度检查，若呈阳性者，则视为生化妊娠。ET 5周后，若超声检查提示孕囊及见胎心管搏动者，则视为临床妊娠。
本研究采用SPSS 17.0统计学软件包对数据进行统计学处理，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验。以P<0.05示差异有统计学意义。
IVF失败后6 h与22 h采取挽救性ICSI的结局比较(表1)。6 h组每个周期至少有1个ET成功，22 h组有2个周期无ET，校正后的平均ET数为(1.5±0.7)个。6 h组共有7个(43.8%，7/16)周期获得临床妊娠，单胎妊娠为6例(男、女婴各为3例)，双胎妊娠为1例(2男婴)；22 h组13个可移植周期中无一例获得临床妊娠(另2个周期因无ET而放弃)。
IVF失败后6 h和22 h采取挽救性ICSI的结局比较[n(%)]
Comparison of results between 6 h and 22 h groups [n(%)]
IVF失败后6 h和22 h采取挽救性ICSI的结局比较[n(%)]
Comparison of results between 6 h and 22 h groups [n(%)]
| 组别 | 卵子数(枚) | MⅡ卵子数(枚) | 受精率(%) | 卵裂率(%) | 可移植胚胎数(%) | ET数(个， ±s) | 临床妊娠率(%) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 6 h组 | 120 | 90(75.0) | 70(77.8) | 69(98.6) | 50(72.5) | 1.8±0.6 | 7(43.8) |
| 22 h组 | 142 | 122(85.9) | 58(47.5) | 46(79.3) | 31(67.4) | 1.3±0.8 | 0 (0.0) |
| P | <0.05 | <0.01 | <0.01 | >0.05 | >0.05 | <0.05 |
常规IVF受精率为60%～70%[6]，受精失败或低受精率时有发生，可能与卵母细胞源于精子有关。卵母细胞不成熟或透明带缺乏相应受体或精子功能障碍，均可致受精失败。对未受精卵补救的有效方法是进行挽救性ICSI。常规挽救性ICSI于受精后第2天上午(受精后22 h)进行，由于卵子老化且胚胎发育和子宫内膜不同步导致临床妊娠率低。受精22 h后卵子的挽救性ICSI受精率为24%～48%，临床妊娠率为6%～20%。即使卵子可受精，由于卵子老化而致优质胚胎较少(仅约为20%)[7]，亦可致临床妊娠率低。本研究结果显示，受精22 h后行挽救性ICSI的受精率为47.5%(58/122)，13个移植周期无一例临床妊娠，与上述研究的结果一致。
常规IVF精、卵共培养2 h即可受精，6 h后有90%受精卵排出第二极体，受精8 h后所有受精卵均可排出第二极体，且80%受精卵在受精后8 h出现原核，因此第二极体可视为卵母细胞受精的标志物。准确判断第二极体是关键。第二极体的形态为规则圆形、椭圆形或碎片，若剥除颗粒细胞的卵子极体为碎片，可延长观察时间直至原核出现。常规IVF受精率为60%～70%，如果受精6 h后≥60%卵子排出第二极体，可认为卵子无受精障碍。
受精6 h后行挽救性ICSI的受精率和临床妊娠率与因男方原因行ICSI治疗周期比较，差异无统计学意义(P>0.05)[8]。卵子受精后原核出现时间、卵裂时间和第3天的卵裂球数目，与常规ICSI周期一致，而受精22 h后行挽救性ICSI的胚胎在第3天的卵裂球为(2～4)个细胞。由于受精6 h后卵子仍具有很高的细胞活力，形成的优质胚胎率远高于受精22 h后卵子行挽救性ICSI形成的优质胚胎率。受精6 h后卵子行挽救性ICSI形成的胚胎细胞数目，与子宫内膜容受性同步。
受精6 h后行挽救性ICSI可显著增加卵子受精率和临床妊娠率，对女方原发性不孕，男方少、弱精子症在精液足够行常规IVF情况下，可在卵子受精6 h后采取观察极体的方式判断卵子是否受精。如果卵子未在足够时间内排出第二极体，可在受精6 h后进行挽救性ICSI。在保证卵子质量的前提下避免受精失败的风险，并可考虑取消部分ICSI(half－ICSI)周期。
