叶酸是1种基本的水溶性维生素，作为一碳单位的供体，在DNA、RNA、蛋白质合成、维持及DNA甲基化等生命活动过程中起着至关重要的作用，叶酸是所有上述反应的限制因素。近年研究结果显示，叶酸缺乏或代谢障碍会增加罹患宫颈癌或宫颈上皮内瘤变(CIN)的风险，但其作用机制至今尚未阐明。笔者拟就叶酸的摄取和代谢、叶酸缺乏影响正常的DNA甲基化、叶酸缺乏影响DNA的合成和修复、叶酸缺乏可以增强致癌病毒的作用等方面进行综述。
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宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，严重危害妇女身心健康。宫颈癌发病率位居女性恶性肿瘤第2位，仅次于乳腺癌[1]。目前，全世界每年约50万宫颈癌新发病例，我国每年宫颈癌新发病例约为13万，死亡病例达2～3万，且发病呈逐渐年轻化趋势[2]。随着微量营养素与肿瘤关系研究的深入，目前已发现叶酸、维生素A、维生素E等营养素摄入不足可增加宫颈癌的发生风险[3]。笔者拟就叶酸与宫颈癌关系的研究进展综述如下。
人体内的叶酸主要以单聚谷氨酸的形式进行转运[4]，而饮食中的叶酸则以多聚谷氨酸的形式存在。因此摄入体内的多聚谷氨酸需要被分解为单聚谷氨酸才能发挥生物效应。叶酸单聚谷氨酸在还原性叶酸载体(reduced folate carrier，RFC)的作用下被小肠吸收，并以5-甲基四氢叶酸单聚谷氨酸的形式在叶酸受体(folate receptor，FR)的辅助下进入细胞。其中起主要作用的为FRα。此外，还有FR β和FR γ，但FR β和FR γ对5-甲基四氢叶酸的亲和力较低。进入细胞后，5-甲基四氢叶酸为半胱氨酸合成甲硫氨酸提供甲基，自身则形成四氢叶酸(tetrahydrofolate，THF)。亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD)有3种功能，分别催化THF向10-甲酰基四氢叶酸、10-甲酰基四氢叶酸向5，10-次甲基四氢叶酸、5，10-次甲基四氢叶酸向5，10-亚甲基四氢叶酸转化。MTHFD在叶酸代谢过程中发挥了重要作用，是叶酸代谢的关键酶。叶酸在嘌呤合成过程中提供一碳单位，此外，脱氧尿嘧啶核苷单磷酸(deoxy-uridine monophosphate，dUMP)由5，10-亚甲基四氢叶酸提供一个亚甲基基团形成脱氧胸腺嘧啶核苷单磷酸(deoxy-thymidine monophosphate, dTMP)，5，10-亚甲基四氢叶酸则脱甲基形成二氢叶酸(dihydrofolate，DHF)。DHF又可以在二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)的作用下还原为THF。5，10-亚甲基四氢叶酸可以在MTHFR的作用下进一步还原为5-甲基四氢叶酸。叶酸作为一碳单位的载体，参与嘌呤、嘧啶等重要物质的生物合成[5]，参与蛋白质代谢、甲硫氨酸循环及氨基酸之间的相互转化，同时亦参与重要甲基化合物的合成，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟。
叶酸与宫颈癌的关系是近年来国内外研究的热点。越来越多的研究结果显示叶酸缺乏可增加宫颈癌的发生风险[6]，但具体发病机制尚不清楚，目前认为可能的作用机制有：①叶酸缺乏影响正常的DNA甲基化；②叶酸缺乏影响DNA的合成和修复；③叶酸缺乏可以增强致癌病毒的作用；④叶酸缺乏时，T淋巴细胞不能正常增殖，损害了机体免疫监视系统，使恶变细胞发生免疫逃逸。其中，学者关注最多的是前2种作用机制。
近年来，国内外关于DNA甲基化的研究越来越多，DNA甲基化作为表观遗传学重要的分子机制之一，受到了越来越多的关注[7,8]。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNA methytrasferase)的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)提供甲基基团并将其共价结合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳原子上，生成5'-甲基胞嘧啶的过程。这种共价修饰主要发生在CpG岛，所谓CpG岛是指基因组序列中CpG二核苷酸的含量超过其他区域10倍以上的特定区域，通常位于基因启动子区或其他调控区域[9,10]。不过，DNA甲基化也不仅仅局限于CpG岛内，"CpG岛海滩(CpG island shores)"一词用来描述在基因组中紧邻CpG岛(距离不超过2 kb)，CpG密度较低的区域。发生于CpG岛海滩内的DNA甲基化修饰现象也与基因转录抑制有着密切关系。但是绝大部分组织特异性的DNA甲基化修饰现象似乎都发生在CpG岛内，而不是CpG岛海滩内。
DNA甲基化与基因表达沉默相关，CpG岛异常高甲基化可能导致抑癌基因转录失活，从而使抑癌基因表达沉默，而CpG岛异常低甲基化，可能导致原癌基因被激活，从而诱发细胞癌变[11,12]。李碧岚和万小平[13]研究结果发现，在宫颈癌的发生、发展过程中多种基因发生了甲基化修饰，且甲基化程度与宫颈病变程度有一定相关性。如CDH13、CDH1、DAPK1、CADM1、HOXA11、TWIST1、RAR-β、CDKN2a、RASSF1、SOX1等因子[13]。Wentzensen等[14]对4 376例不同级别宫颈病变患者的研究结果发现，DAPK1、CADM1、RAR-β等基因甲基化现象广泛存在于宫颈癌组织中。Widschwendter等[15]在宫颈癌患者血清中检测CDH13和CDH1甲基化状态，发现CDH13及CDH1甲基化呈阳性的宫颈癌患者比呈阴性患者的预后差。Missaoui等[16]在宫颈正常组织、良性病变组织、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅰ～Ⅲ及宫颈癌组织中检测CDH13、DAPK1基因甲基化，发现在CIN Ⅰ～Ⅲ及宫颈癌组织中CDH13、DAPK1启动子均发生甲基化，且随着病变的进展，甲基化程度增加(P<0.05)，而在正常宫颈组织及良性病变组织中，CDH13、DAPK1基因未发现甲基化。Pathak等[17]研究结果显示，从正常组织进展到宫颈癌，CDH1、RARβ及HIC1的甲基化频率逐步增加，二者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
尽管目前已有多种假设，但仍不清楚参与调控基因沉默的是CpG岛内某几个关键的CpG位点超甲基化，还是整个CpG岛超甲基化，或是二者皆有。迄今，有3种可能的作用机制可解释DNA甲基化的转录抑制过程。第1种机制是DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位置结合，几种转录因子能识别CpG残基的序列，当CpG残基上的C被甲基化后结合作用即被抑制，但是许多转录因子对DNA甲基化不敏感，也并非所有和转录因子结合的特异DNA序列都包含CpG二核苷酸，DNA甲基化对上述这些转录因子基本不起抑制作用。第2种DNA甲基化转录抑制机制是通过在甲基化的DNA上结合特异的转录阻遏物，又称为甲基-CpG结合蛋白，而起作用[18]，这种蛋白质能与转录因子竞争甲基化的DNA结合位点。第3种机制是通过影响染色质结构。DNA甲基化的转录抑制仅在染色质组装后，即使一个很强的转录活化因子也不能抵消由于DNA甲基化作用诱导的染色质失活所产生的效果。此外，除了稳定失活状态外，DNA甲基化也能通过阻止转录因子的进入以阻遏染色质的活化。
在正常情况下，DNA甲基化后基因转录被抑制，叶酸缺乏可以影响DNA甲基化，使被阻滞的基因发生转录。在肿瘤发生过程中，叶酸缺乏可引起甲基化模式紊乱，具体表现为癌基因的低甲基化和抑癌基因CpG岛的高甲基化。越来越多的研究结果发现，叶酸和DNA甲基化之间的关系非常密切。叶酸是甲基集团的来源之一，叶酸缺乏时，SAM合成减少，影响甲基基团的供给，从生化途径上影响DNA甲基化。体内外实验结果均证实，叶酸缺乏可导致基因组低甲基化和染色体损害[19,20]。Jocob等[21]研究结果显示，叶酸水平低时，其代谢产物5-甲基四氢叶酸的基因组甲基化水平也降低；补充叶酸后，则升高。叶酸缺乏可引起DNA甲基化模式紊乱，尤其对抑癌基因的影响更为严重。实验诱导的动物DNA甲基化异常可调控裸鼠发生肿瘤[22]，主要与抑癌基因P53的甲基化调控作用有关。Shiff等[23]研究结果显示，叶酸缺乏可导致抑癌基因P53编码区域低甲基化，补充叶酸则可逆转该区域发生的低甲基化现象。在肿瘤发生过程中，基因组DNA总体的甲基化水平降低，而低甲基化的肿瘤患者，体内叶酸水平也往往低于健康个体。诸多研究结果发现，宫颈癌组织和细胞中P16基因等抑癌基因CpG岛高甲基化，而c-Myc等癌基因CpG岛低甲基化[24,25]。Nuovo等[26]以原位杂交甲基化特异性聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)方法研究宫颈癌抑癌基因P16的甲基化程度，发现P16基因的高甲基化往往发生在早期宫颈癌患者中，因甲基化使p16蛋白表达缺失，导致宫颈癌变并进一步发展为浸润性宫颈癌。Dong等[27]对53例宫颈癌标本中的6种肿瘤相关基因启动子的甲基化状态进行研究，结果发现79%标本中有至少1种基因的启动子区域发生异常甲基化，而对照组中均未发生甲基化。这提示在宫颈癌发生、发展过程中，启动子区的异常甲基化是一种频发的现象。高晨菲等[28]研究结果显示，叶酸可降低FHIT抑癌基因的DNA甲基化水平，逆转其在转录和功能水平的异常表达。
叶酸是一碳单位的载体，其携带的一碳单位可用于嘌呤、嘧啶、氨基酸的最初合成，并可用于氨基酸之间的相互转化，是核酸的主要组成部分，因此在细胞分裂和增殖中起着主要作用。叶酸同时是一种辅酶，和相关的酶结合参与机体代谢过程。叶酸在嘌呤和嘧啶核苷酸的合成中起着非常重要的作用，直接影响蛋白质和DNA的合成，维持DNA完整性和稳定性。流行病学相关证据显示，叶酸缺乏可干扰正常的DNA代谢过程，影响DNA合成和修复，使肿瘤发病风险升高。其具体机制可能表现为尿嘧啶错配和DNA修复障碍；此外，叶酸缺乏可影响嘌呤的生物合成，使可利用的核苷减少从而影响DNA合成及修复[29,30]。叶酸在核苷酸合成过程中起着非常重要的作用，以叶酸代谢产物5，10-甲炔基四氢叶酸作为甲基供体，dUMP在胸腺嘧啶脱氧核糖核苷合成酶的作用下转变为dTMP，再合成dNMP。叶酸缺乏时，无法提供充足的甲基，导致dUMP不能甲基化为dTMP，从而使dUMP过量堆积，二者比例发生失调，DNA聚合酶无法及时识别dUMP和dTMP时，dUMP便代替dTMP被错误掺入DNA中，而DNA中尿嘧啶掺入过多会增加DNA双链断裂的机会，导致DNA不稳定性增高，进一步促进细胞恶性转化，从而增加了肿瘤发生风险。Baylin等[31]相关研究结果亦与此相符。
叶酸缺乏时，尿嘧啶错误掺入DNA的机会增加，掺入的dUMP可被损伤修复系统识别，并由特异性糖苷酶切除，如果在距离小于12 bp的互补DNA双链上同时切除dUMP，将导致双链短暂断裂；如果叶酸缺乏一直持续，尿嘧啶的错误掺入和不断修复将陷入无效的恶性循环中，并最终导致DNA分子频繁发生断裂，从而引起染色体结构断裂、损伤。如果dUMP未被及时切除，将在后续的DNA复制过程中发生G-C交换，引起基因突变，为细胞恶性转化创造了条件。Choi等[32]研究叶酸缺乏对小鼠结肠的影响时发现，叶酸缺乏可使DNA切除修复能力下降；同样的结论出现在叶酸缺乏对人体永生化结肠细胞的体外实验中，该研究显示叶酸缺乏时不能有效修复DNA损伤[33]。
研究结果证实，人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的持续感染是宫颈癌发生的主要原因，HPV病毒的E6基因和E7基因是主要的癌基因，在细胞恶性转化和永生化中起主要作用[34]。E2基因调控病毒癌基因的转录过程，可阻断E6、E7基因的转录。在病毒基因组整合到宿主细胞染色体的过程中，往往造成E2基因片段的缺失或功能失活，使E6基因过表达，从而导致E2、E6基因比例失调，促进细胞发生恶性转化[35] 。郑莹等[36]研究结果显示，HPV16整合状况与宫颈病变程度密切相关，随着不同级别CIN到宫颈浸润癌病变级别的升高，HPV16整合几率也增加。由此可见，宫颈癌细胞中HPV的整合可能影响HPV癌基因的表达。此外，亦有研究结果表明，叶酸缺乏可能在宫颈癌前病变阶段起作用，对已发生的宫颈癌变则作用不明显，补充叶酸可逆转宫颈癌前病变的进展。提示叶酸可能在癌变初起时影响HPV病毒癌基因的转录和复制，而对已癌变细胞HPV病毒转录产生的作用微弱[37,38]。Piyathilake等[39]随访研究结果发现，体内叶酸水平高的HPV16呈阳性妇女发生CINⅡ及其以上病变的几率低于体内叶酸缺乏者，提示叶酸缺乏可能促进HPV16的妇女感染的妇女发生宫颈癌。另有研究结果显示，血清叶酸缺乏同时感染HPV16罹患宫颈癌的危险度为17.45，且存在交互作用[6,40]。提示叶酸缺乏可能与HPV感染存在协同作用，增加宫颈癌的发生风险。
综上所述，叶酸缺乏可能通过影响DNA的甲基化和DNA合成及修复功能，使宫颈癌发病风险上升；补充叶酸可改善CIN情况，抑制癌细胞增殖，可能会降低宫颈癌发生风险。但迄今为止，叶酸在宫颈癌发生、发展中的作用及确切作用机制尚未阐明，尚需大样本量的随机、双盲对照实验进一步研究证实。
