Duchenne型肌营养不良(DMD)是由抗肌萎缩蛋白基因Dystrophin发生移码突变导致的儿童遗传性致死性肌病。反义寡核苷酸(AON)靶向外显子中的剪接调控序列可以诱导Dystrophin基因的相应外显子跳读，以恢复dystrophin mRNA阅读框，是目前新的DMD治疗方法。该治疗方法的有效性已在患者来源的肌细胞及动物模型中得到证实。目前，AON靶向治疗DMD已经进入药物临床试验阶段。笔者拟对DMD的分子致病机制、AON治疗DMD的作用机制及其临床试验新进展进行综述，为AON在DMD治疗中的临床应用提供理论依据。
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Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是目前儿科最常见的严重遗传性肌肉疾病，好发于男性患儿。该病是由抗肌萎缩蛋白基因Dystrophin发生基因突变引起抗肌萎缩蛋白缺失而导致的肌肉疾病。进行性肌肉变性坏死、继发性炎症反应及纤维化是DMD基本病理学特征。该病患儿通常于9～12岁失去行走能力，于30岁前因呼吸循环衰竭导致死亡。因此，寻找DMD的有效治疗方法至关重要。近年来，随着学者对DMD致病基因及分子致病机制认识的不断深入，以反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide，AON)干预剪接为代表的分子治疗方法逐渐进入临床试验阶段。笔者拟就DMD的分子致病机制、AON治疗DMD的作用机制及其在临床试验中的最新研究进展进行综述如下。
Dystrophin基因定位于Xp21区，是人类基因组中长度最长的基因之一[1]。dystrophin mRNA全长为14 kb，包含79个外显子，可编码分子量为427 000 D的抗肌萎缩蛋白。抗肌萎缩蛋白表达于肌细胞膜内表面，其氨基端和羧基端的半胱氨酸富集区将肌动蛋白(F-actin)与肌膜及细胞外基质相连接，在肌肉收缩时发挥保护细胞膜免受机械性损伤的作用；而中央杆状区虽然占抗肌萎缩蛋白总长度的80%，但对其蛋白功能却无显著影响[2]。
Dystrophin基因突变频率较高并且突变类型较复杂，目前其已知的突变类型包括基因缺失、重复、点突变及染色体异常等。其中，外显子缺失为最常见的Dystrophin基因突变类型，其突变集中分布于2～20号和45～55号外显子这2个热点区，发生率为60%～65%；其次为点突变，发生率为30%；外显子重复居第三位，发生率为5%～8%[3,4,5]。上述基因突变类型除可引起严重DMD外，还可以导致Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy, BMD)。与DMD相比，BMD患者起病较晚、症状较轻，病情进展较缓慢，生存期长[6]。
阅读框是位于基因转录产物mRNA上的从起始密码子到终止密码子间的一段编码序列。在阅读和翻译过程中，核糖体由起始密码子AUG开始，按三联体方式连续、不重复地合成蛋白质[7]。而阅读框内碱基的插入或缺失，常可导致蛋白质结构和功能异常。国内、外学者对DMD或BMD患者基因型与临床表型间关系的研究发现，若移码突变、无义突变等基因突变破坏dystrophin mRNA的阅读框，并且提前终止蛋白质合成，则可导致症状严重的DMD表型；若移码突变等基因突变未破坏dystrophin mRNA的阅读框，使患者体内能够合成氨基端、羧基端完整而中间缺失的具有部分功能的抗肌萎缩蛋白，则引起症状较轻的BMD表型。此规律又被称为"阅读框规则" (reading frame rule)[8,9,10]。由此可见，dystrophin mRNA的阅读框是否被基因突变破坏是决定DMD或BMD表型的分子学基础，如果能够在转录水平恢复阅读框，则有可能将症状严重的DMD表型转变为症状较轻的BMD表型。
在基因表达过程中，mRNA前体需要经过剪接 (splicing) 过程以移除非编码的内含子，并将编码蛋白质的外显子连接在一起[11]。在剪接过程中，mRNA前体正确识别外显子的发生机制较复杂，其中外显子与内含子临界的高度保守序列 (5′和3′端剪接位点) 和内含子3′端上游的分支点对维持正常剪接过程发挥重要作用。而基因编码区也存在剪接时调控外显子识别强度的核苷酸序列，包括促进外显子识别的剪接增强子(exonic splicing enhancer, ESE) 和阻碍外显子识别的剪接抑制子 (exonic splicing silencer, ESS)[5,12]。
Matsuo等[13,14]于1990年首次在Dystrophin基因中发现ESE，该研究在1例DMD患者Dystrophin基因的19号外显子中发现52个碱基缺失，而该突变在未破坏5′和3′端剪接位点的情况下导致19号外显子在剪接中被切除，该过程又被称为外显子跳读(exon skipping)。此后研究结果显示，缺失的核苷酸序列中含有促进外显子识别的重要信号——ESE[15]。而Pramono等[16]体外剪接研究结果显示，阻断ESE信号可以诱导正常的19号外显子跳读，该结果证实ESE在dystrophin mRNA前体剪接中发挥了重要作用。
AON是人工合成并经过化学修饰的单链DNA或RNA，长度仅为20～30 bp，其组织透过性好，可以通过碱基互补配对方式与靶向目标核苷酸结合，常用于沉默基因的表达[17]。1993年，Dominski和Kole[18]将AON应用于基因的剪接调控，利用AON阻断地中海贫血致病基因中异常激活的5′和3′剪接位点，使β-球蛋白mRNA前体剪切恢复正常。
Dystrophin基因中ESE的发现，可使外显子序列成为AON干预基因剪接的新靶点。1995年，Takeshima等[15]率先提出以AON靶向封闭DMD患者Dystrophin基因中的ESE，并诱导特定外显子跳读以恢复dystrophin mRNA的阅读框。该研究拉开AON靶向治疗DMD的序幕。与基因进化过程中位于剪接位点的保守序列相比，AON靶向外显子序列具有下列优点：①特异性高，可以有效防止AON与结合位点的脱靶现象；②外显子序列中鸟嘌呤和胞嘧啶含量较高，与AON有较强的结合力[19]。
AON理论上可通过切除Dystrophin基因中突变处或突变周围的1个或几个外显子，以治疗大部分发生基因缺失、重复和无义突变的DMD患者。仅有约10%的DMD患者因染色体异常或突变位于氨基端和羧基端的重要功能区，而不适用AON靶向治疗[20]。而AON靶向治疗DMD的可行性亦被DMD患者自然发生的外显子跳读现象所证实。1997年，Shiga等[21]对1例BMD患者的研究结果显示，其Dystrophin基因27号外显子发生无义突变，然而根据"阅读框规则" ，该突变在理论上应该提前终止蛋白合成，并且导致严重的DMD表型，但是对其dystrophin mRNA进一步研究发现，其携带的无义突变27号外显子(长度为183 bp)在部分转录产物中被切除，使阅读框得以恢复，故仅引起BMD表型。该研究结果可以较好解释患者基因型与其临床表型之间具有差异的原因。此后，Flanigan等[22]研究结果也得出相似结论。上述研究结果表明，Dystrophin基因的外显子跳读产生的抗肌萎缩蛋白虽然具有内部缺失，但是仍具有改善患者临床表型的功能。
AON诱导Dystrophin基因发生外显子跳读是一种特异性的突变治疗方法，因此不同部位的基因突变通常需要AON对不同的外显子进行靶向治疗。已有研究结果显示，在体外剪接实验及人源淋巴母细胞实验中，AON可成功诱导Dystrophin基因19号外显子跳读[15,16]，而Takeshima等[23]在对1例Dystrophin基因20号外显子缺失的DMD患者来源肌细胞的研究结果显示，AON可成功恢复其抗肌萎缩蛋白表达。Takeshima等[24]还通过对DMD模型鼠——性联遗传肌肉萎缩症(X-linked muscular dystrophy，MDX)小鼠进行AON全身给药的研究结果证实，AON在体内可以被骨骼肌细胞核摄取、诱导Dystrophin基因19号外显子跳读。与此同时，van Deutekom等[25]研究结果也显示，AON在患者来源的肌细胞中可诱导Dystrophin基因46号外显子跳读。此后，针对Dystrophin基因2～78号外显子，研究者们先后设计了400多条AON，并且其有效性已经在人源肌细胞和动物模型研究中得到评估和证实[26,27]。
Takeshima等[28] 于2006年对1例年龄为10岁的日本DMD志愿者进行AON靶向治疗的首次临床实验，接受治疗前该志愿者Dystrophin基因20号外显子缺失(长度为242 bp)并已经失去行走能力，该实验的作用原理是诱导Dystrophin基因19号外显子(长度为88 bp)跳读以修复阅读框，恢复dystrophin蛋白表达；该志愿者接受了针对Dystrophin基因19号外显子内ESE的硫代磷酸脱氧寡核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotide, PS-AON)的静脉注射治疗，[0.5 mg/(kg·周)]×4周，患者未发生药物不良反应；治疗结束1周后肌肉活组织病理检查结果证实，约6%的Dystrophin基因转录产物发生19号外显子跳读，免疫组织化学染色结果显示少量抗肌萎缩蛋白表达。虽然AON诱导Dystrophin基因的19号外显子跳读仅适用于较少部分DMD患者，但上述试验结果使AON靶向治疗的临床应用迈出具有历史意义的一步。
DMD患者最常见的缺失突变主要集中在2～20号和45～55号外显子这2个热点区，AON靶向作用于这些区域的外显子，可以对较大部分的DMD患者发挥治疗作用[29]。Leiden Muscular Dystrophy page(www.dmd.nl)的研究结果显示，分别诱导Dystrophin基因51、45和53号外显子跳读，可以治疗13.0%、8.1%和7.7%的DMD患者[5]。因此，针对Dystrophin基因51、45和53号外显子的AON研发成为研究热点。其中，已有多项研究结果显示，drisapersen和eteplirsen这2种AON药物可诱导Dystrophin基因51号外显子跳读[30,31,32]。
Drisapersen属于2′-氧-甲基硫代磷酸酯寡核苷酸(2′-O-methyl phosphorothioate oligonucleotides，2OMePS)，由荷兰莱顿大学医学中心(Leiden University Medical Centre)及Prosensa公司先后与英国GlaxoSmithKline公司和美国Biomarin公司合作研发[30]。目前，已被报道的2项drisapersen治疗DMD患者的Ⅱ期药物临床试验中，drisapersen均采用皮下注射给药方式，患者治疗后常见药物不良反应为注射位点反应和轻度蛋白尿，无一例患者发生严重药物不良反应[31,32]。其中，Goemans等[31]开放性Ⅱ期药物临床试验研究结果显示，12例DMD患者(年龄为5～13岁)分别接受drisapersen治疗，剂量为[(0.5～6.0) mg/(kg·周)]×12周，肌肉活组织病理检查结果显示患者具有剂量依赖性抗肌萎缩蛋白表达，并且其表达量最高可达正常肌肉组织表达量的15.6%；在随后12周的扩展试验中，所有患者接受drisapersen最大剂量6.0 mg/(kg·周)治疗的结果显示，8例患者6 min步行距离较治疗前均有不同程度增加[31]。另1项由53例DMD患者(年龄为5～11岁，平均为7.5岁)参与、为期25周的随机、双盲、安慰剂对照试验结果也证实了drisapersen的疗效，该研究中用药组患者6 min步行距离较安慰剂组多31.5 m[32]。然而，近期1项大型drisapersen Ⅲ期药物临床试验并未达到预期效果，该研究186例DMD患者(年龄为5～16岁，平均为8.2岁)经48周drisapersen治疗后，drisapersen组患者6 min步行距离与安慰剂组比较，未得到明显改善(clinicaltrials.gov, NCT01254019)[6,33,34,35]。究其原因，可能是上述研究纳入更多年长及病变严重的患者而影响其Ⅲ期临床试验结果所致[6]。
Eteplirsen是靶向51号外显子的磷酰吗啉寡核苷酸(morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides, PMO)，由英国多学科企业联盟(mutlidisciplinary enterprise consortium，MDEX Consortium)和美国Sarepta Therapeutics公司合作研发[30]。目前临床研究结果显示，eteplirsen这种新型AON在细胞内具有稳定性强、药物不良反应小等优点[36,37]。有2项小型Ⅱ期药物临床试验结果显示，eteplirsen经静脉注射给药，可以不同程度恢复DMD患者的抗肌萎缩蛋白表达，其表达量最高可达正常肌肉组织表达量的18%，并且患者耐受性良好，其常见药物不良反应为轻度蛋白尿[38,39]。Mendell等[39]由12例DMD患者(年龄为7～13岁)参与的随机、双盲、安慰剂对照试验及后续的开放性扩展试验结果显示，eteplirsen组[注射剂量分别为30 mg/(kg·周)和50 mg/(kg·周)]患者治疗48周后6 min步行距离较安慰剂/延迟给药组患者增加67.3 m。
作为一种新型治疗方法，AON诱导外显子跳读在药物临床试验中取得一定进展的同时，也面临很多问题和挑战。
由于drisapersen的Ⅱ期和Ⅲ期药物临床试验结果具有较大差异，因此，如何优化这些新型药物的临床试验设计成为研究者的关注热点。新型AON药物靶向治疗DMD患者的起始用药时间、疗程、疗效评价指标，以及联合使用AON与糖皮质激素对疗效的影响等，均有待进一步研究证实。
DMD以起病早、病情持续进展为主要特点，患者婴幼儿期已经出现可测量的粗大和精细运动功能缺陷[40]，5岁时与同龄健康儿童相比肌力下降50%～60%[41]，随着年龄增长，患儿骨骼肌进行性坏死并逐渐被纤维结缔组织和脂肪组织替代。因此，DMD确诊后早期用药有利于保留更多肌肉组织以维持患者行走能力。
目前虽然多个Ⅱ期临床试验结果显示drisapersen和eteplirsen短期(≤48周)可以稳定病程进展，但其长期疗效尚待观察。特别要注意的是，参与临床试验的DMD患者通常年龄跨度大，临床异质性高，其中年幼患儿受生长发育的影响，运动功能处于提升阶段，短期用药可能检测不到行走能力的下降；而年长患儿病变较为严重，更需要持续用药以评估疗效[17]。
多个Ⅱ期临床试验结果显示6 min步行距离是DMD治疗有效的功能评价指标。然而，该检测方法仅适用于有行走能力的患者。近期TREAT-NMD建立了更完善的功能评价体系，适用于不同年龄患者(包括轮椅依赖者)，其有效性尚需临床试验进一步验证[6]。
AON诱导外显子跳读是目前DMD最有前景的治疗方法之一，并且在基础研究和临床试验中取得迅速进展，为DMD患儿及家庭带来希望。针对51号外显子的2个反义药物drisapersen和eteplirsen目前正在申请新药认证，其更令人鼓舞的Ⅲ期临床试验结果及新药审批的进展值得期待。
