8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是DNA氧化损伤产物之一。8-OHdG水平可反映机体氧化损伤程度，是目前国际上公认的评价DNA氧化损伤和氧化应激(OS)状态的新型指标和生物标志物。笔者拟就8-OHdG的主要检测方法及其在OS与儿童相关疾病的最新研究进展进行阐述，旨在为临床对该类疾病的诊断与治疗提供参考依据。
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氧化应激(oxidative stress，OS)，是指机体或细胞内以氧自由基为代表的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生与消除失衡，或外源性氧化物质摄入过量，导致细胞内氧化性物质蓄积，氧化作用大于抗氧化作用，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，从而引起氧化反应的状态[1]。8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)是ROS直接攻击DNA鸟嘌呤碱基第8位碳原子，而产生的一种氧化性加合物，可在人类8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶(human 8-oxoguanine DNA glycosidase，hOGG)l的作用下，通过碱基切除、核苷酸切除修复等机体自我保护机制，从DNA链上被切除，生成游离8-OHdG，随尿液排出体外，进而可实现临床对机体8-OHdG水平的无创检测[2]。8-OHdG在人体内的半衰期长达55 min，比一般OS相关标志物的半衰期时间长[3]。8-OHdG一旦躲避机体的自身修复，则可能成为致畸、致癌、致突变的启动因子[4]。8-OHdG不是细胞更新的产物，在系统循环中不是通过鸟嘌呤氧化生成，而是通过DNA氧化损伤途径形成，可在体内稳定存在，不受饮食等因素的影响，为OS代谢终产物。因此，8-OHdG水平可反映机体氧化损伤程度，既是个体外源性物质导致机体氧化损伤的接触性标志物，又是反映外来因素作用后，机体中可测定的生化、生理、行为或其他方面改变的效应标志物[5]。8-OHdG是目前国际上公认的一种评价DNA氧化损伤和OS状态的新型指标和生物标志物。
近年研究表明，测定机体8-OHdG水平，对研究机体的衰老机制、退行性疾病、癌症发生机制、慢性炎症疾病、环境毒物与职业病、临床上其他不明原因疾病等，均具有重要意义[6]。此外，8-OHdG水平还可用于评价抗氧化剂治疗效果[6]。目前，国内外主要通过检测组织DNA、血液、唾液及尿液中8-OHdG水平，阐明上述疾病发病机制，从而探索这些疾病新的诊断、治疗方法。笔者拟就目前8-OHdG的检测方法及其在OS与儿童相关疾病的最新研究进展进行阐述，旨在为临床对该类疾病的诊断与治疗提供参考依据。
高效液相色谱-电化学检测器分析法(high-performance liquid chromatography-electrochemical detection，HPLC-ECD)是指将组织细胞或尿液中提取的DNA，使用酶水解为单核苷酸后，首先采用高效液相色谱进行分离，然后再采用电化学检测器和紫外线检测器，分别测定样品中8-OHdG与脱氧鸟苷(deoxyguanosine，dG)水平，8-OHdG水平与dG水平的比值，即表示DNA氧化损伤程度。该方法检测8-OHdG水平敏感度较高，重复性好，最低检测限值为(20～30)×10－15 mol/μmol核苷，具有检测所需样品量少，无创、快速、选择性高、分辨率高、线性动力学范围大、可连续操作、不受色谱柱参数(洗脱液流速等)影响等优点，是目前较为成熟、应用广泛的8-OHdG检测方法[7]。采用HPLC-ECD检测8-OHdG水平的研究结果发现，吸烟者淋巴细胞DNA中8-OHdG水平较不吸烟者显著增高，二者比较，差异有统计学意义(P<0.05)[8]；乳腺癌患者尿液8-OHdG水平显著高于健康妇女，二者比较，差异亦有统计学意义(P<0.01)[9]。该方法在进行高效液相色谱分离前，存在DNA酶解不完全的情况，可导致8-OHdG检测水平较实际水平高，并且测定时对高效液相色谱分离技术要求较高，对目标物的选择性和抗干扰能力，受高效液相色谱分离技术和电化学检测器的限制等缺点[10]。由于液相色谱泵、自动进样器和电化学检测器等仪器价格较高，使得该方法难于广泛应用于临床常规检测8-OHdG水平。
超高效液相色谱-串联质谱联用法(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)是指将待测样品，如尿液，从冷冻冰箱中取出，经水浴解冻、离心处理后，提取上清液，加入甲酸-甲酸铵溶液混匀，放置10 min后，转移至已活化的固相萃取柱中，使用甲醇洗脱后，将浓缩的洗脱液置于0.22 μm微孔滤膜过滤，再检测8-OHdG水平。该方法操作简便，检测敏感度及回收率高，前期处理过程简单，可满足实际样品的分析测定要求[11]。采用该方法对8-OHdG水平进行检测时，目标化合物保留时间短，可使基质效应降至最低，从而提高分离效率，减少溶剂使用量，缩短检测时间，仪器检测过程仅需3 min即可完成[12]。罗顺斌等[13]采用UPLC-MS/MS检测大鼠肾组织DNA 8-OHdG水平的结果发现，糖尿病模型组大鼠造模成功3个月时，肾组织DNA 8-OHdG水平高于非糖尿病组。采用该方法进行组织8-OHdG水平检测的结果还证实，不同类型胃癌组织与正常组织中8-OHdG水平存在显著差异[14]。由于超高效液相色谱仪和串联质谱仪价格昂贵，该方法在一般实验室中难以开展。
酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是指首先将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原或抗体与酶结合，形成酶标抗原或抗体复合物，该复合物具有双重活性，即免疫活性和酶活性；然后在固相表面加入反应底物，底物被复合物催化生成有色产物，颜色越深表示产物越多，最后根据产物颜色深浅，进行定性或定量分析，产物的量与样品8-OHdG水平直接相关。该方法可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，可用于生物样品的定量测定，亦可用于分析DNA和RNA的氧化损伤产物。该方法无需分解、处理DNA，检测仪器价格较低，应用价值较高，并且8-OHdG水平在一定范围内，与被检测样品浓度具有非常好的线性关系，可进行定量检测。张俊芳等[15]使用该方法检测8-OHdG水平发现，50岁以上健康人群中，年龄大、日照时间长的男性血浆8-OHdG水平，分别较年龄相对较小、日照时间较短的男性高，并且差异均有统计学意义(P<0.05)。多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者血浆8-OHdG水平，显著高于健康对照组[16]。ELISA操作简便，检测8-OHdG水平准确性高(标准品线性回归与预期浓度相关系数r≥0.99)，敏感度高(最低检测浓度<0.1 ng/mL)，重复性好，检测所需时间短，尿液样品预处理程序简单，但存在特异度低，即抗原、抗体之间的交叉反应和批次间检测结果差异较大等问题，仅适合于样品种类单一，样品数量较少的8-OHdG水平检测，以避免样品种类过多引起交叉反应，以及因数量较多，分批次检测差异较大等问题。
免疫组化法是应用抗体与抗原特异性结合的原理，通过化学反应，使标记抗体的显色剂显色，来确定组织细胞内的抗原(多肽和蛋白质)。采用该方法对8-OHdG水平进行检测，不仅可进行定性及相对定量检测，还可检测出8-OHdG在细胞内的分布情况。罗顺斌等[13]使用该方法检测8-OHdG水平发现，糖尿病模型组大鼠造模成功3、6个月时，DNA氧化损伤水平均高于健康对照组大鼠。该方法还证实，在胃癌组织中8-OHdG主要分布于肿瘤细胞的细胞质和细胞核内[14]。免疫组化法检测8-OHdG水平，亦存在背景干扰较大及非特异性抗原、抗体交叉反应等不足。
放射性同位素32P-后标记法(32P-postlabeling assay)是指通过放射性的定量分析检测机体组织8-OHdG水平，该方法具有敏感度高、检测所需样品量少(10－9 g级DNA样品)、费用低廉、操作简便、应用范围广等优点。潘洪志等[17]使用该方法测定正常小鼠不同组织中8-OHdG水平的结果发现，肝脏中8-OHdG水平最高，而肾脏组织中8-OHdG水平最低，究其原因可能与8-OHdG通过肾脏随尿液排出体外有关。该检测法对检测人员具有放射性危害，容易对环境造成放射性污染。该方法还存在分离时间长、自动化程度低、检测工作量大、特异性差等缺点，严重限制了放射性同位素32P-后标记法对大样本机体组织检测8-OHdG水平检测中的应用。
8-OHdG作为OS产物，临床上将其作为OS导致组织损伤的辅助检测指标，已广泛用于2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)，乳腺癌，原发性肝癌，心血管疾病，阿尔茨海默病及PCOS等疾病的早期诊断[18]。通过检测糖尿病患者和糖耐量减低患者尿液8-OHdG水平，可反映从糖耐量减低到糖尿病进展过程中所伴随着机体OS状态加重[19]。通过对乳腺癌和肝癌进行研究的结果证实，尿液8-OHdG水平可作为临床诊断乳腺癌和肝癌，以及评价患者手术治疗效果的潜在和辅助性生物学指标[20,21]。尿液或血清8-OHdG水平，可有效反映慢性心力衰竭患者心力衰竭严重程度及其心脏功能[22,23]。基于尿液和脑脊液8-OHdG水平变化，可为临床评估混合性痴呆患者的病情进展，提供临床依据[24,25]。PCOS的发生，可能也与8-OHdG水平有关，而8-OHdG水平与肥胖的发生，并无明显相关性[26,27]。上述研究结果均证实，OS与8-OHdG水平在成年人相关疾病中的研究已较成熟，而对于儿童相关疾病的研究，则尚处于起步阶段。
围生期母亲、胎盘、羊水、脐带、胎儿因素等异常，均可能引起新生儿窒息及机体发生缺氧缺血性损害，而脑细胞对缺氧最敏感。动物实验结果表明，大脑发生缺氧缺血损伤12 h后，其血清8-OHdG水平显著升高，发生缺氧缺血损伤24 h时，其血清8-OHdG水平达高峰[28]。这提示，可通过检测DNA氧化损伤标志物8-OHdG水平，对急性脑损伤严重程度进行临床诊断。李晓梅等[29]通过检测缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)足月患儿血清8-OHdG水平的研究结果发现，HIE足月患儿出生后第1、3、7天血清8-OHdG水平，均显著高于健康对照组的同期水平，并且血清8-OHdG水平与HIE严重程度呈正相关关系。由此推测，8-OHdG可能参与HIE的病理、生理过程，并且8-OHdG水平与该病严重程度密切相关。动态监测机体血清8-OHdG水平，可为临床治疗及评估该病预后提供参考依据。
目前国内对于早产儿脑损伤的研究，主要集中于颅内出血、HIE、脑瘫等疾病的诊断、治疗和流行病学研究等方面，而对于早产儿脑损伤的病理发生机制的研究，则相对较少[30]。早产儿脑损伤的发生，可能与少突胶质细胞、细胞因子、宫内感染、绒毛膜羊膜炎等有关[30]。研究结果显示，早产儿脑损伤患儿外周血和尿液8-OHdG水平，均显著高于健康对照组，并且与新生儿神经行为测定评分呈负相关关系[31]。这提示，外周血和尿液8-OHdG水平，可作为早产儿脑损伤的早期诊断指标，OS和DNA氧化损伤，可能是早产儿脑损伤的发病机制，将为有效防治早产儿脑损伤提供新的理论依据。
早产儿喂养不耐受(feeding intolerance，FI)是新生儿时期因胃肠道功能紊乱，导致喂养计划中断的一组临床综合征，主要表现为腹胀、胃潴留和呕吐。早产儿FI的发病机制目前尚不明确，其发病影响因素较多，对早产儿影响较大，包括延长住院时间、影响基础疾病恢复和降低存活率，甚至影响早产儿远期生长发育。目前，国内外有关早产儿FI的研究，多局限于对早产儿FI临床疗效观察、诊断标准的统一和高危因素的探讨，有关早产儿FI发病机制的基础研究相对较缺乏[32]。研究结果发现，FI早产儿出生后第1天外周血8-OHdG水平和出生后第1、7、14尿液8-OHdG水平，均显著高于同期喂养耐受组早产儿的水平，并且差异均有统计学意义(P<0.05)[33]。由此推测，8-OHdG水平增高可能与早产儿FI有关，OS和DNA氧化损伤，可能参与早产儿FI的发病过程。
侯小霞[34]通过对健康儿童尿液8-OHdG水平检测的结果发现，儿童尿液8-OHdG水平随年龄增大而增高，7～8岁组儿童尿液8-OHdG水平高于3～4岁组儿童，差异有统计学意义(P<0.05)；对于同年龄组儿童，其身高、体重、头围、胸围等生长发育指标与其尿液8-OHdG水平无相关性(P>0.05)，并且男性、女性健康儿童尿液8-OHdG水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。相对于低龄儿童，高龄儿童机体处于一个较高的OS状态，但8-OHdG是否对儿童生长发育造成影响，仍需更多大样本、多中心、随机对照研究证实。
研究证明，铅(Pb)在体内蓄积中毒后，主要通过产生大量氧自由基，导致机体氧化和抗氧化机制失衡，从而发生DNA氧化损伤，这是机体发生Pb中毒的重要机制之一[35]。廖伟棠等[36]通过对电子垃圾拆解区学龄前儿童静脉血Pb水平和尿液8-OHdG水平的检测结果发现，儿童尿液8-OHdG水平与其静脉血Pb水平呈正相关关系，并且差异有统计学意义(P<0.05)。这提示，随着Pb负荷增高，机体OS反应亦增高，对于Pb污染严重地区，可通过检测儿童尿液8-OHdG水平，间接反映该地区儿童慢性Pb暴露程度。
刘志明等[37]对广西肝癌高发地区儿童尿液8-OHdG水平的研究结果发现，儿童尿液8-OHdG水平与人体质量指数、年龄均呈负相关关系(r＝－0.27，P＝0.01；r＝－0.45，P<0.001)。其中，人体质量指数是儿童尿液8-OHdG水平的独立影响因素；民族和性别差异，对该地区儿童尿液8-OHdG水平，无显著影响。其研究还指出，机体癌变的发生是一个慢性过程，导致成年后发病(肝癌)的原因，有可能在儿童时期就已经存在，如黄曲霉毒素感染。由此推测，对肝癌高发地区儿童尿液8-OHdG水平的检测，可初步预测其成年后罹患肝癌的风险。
综上所述，8-OHdG可反映机体病理状态下，细胞内环境的代谢过程。8-OHdG只通过DNA氧化损伤途径形成，为OS的代谢终产物。8-OHdG水平可作为评价T2DM、癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、PCOS等成年人相关疾病，以及新生儿HIE、早产儿脑损伤与FI、儿童罹患肝癌风险、儿童慢性Pb暴露等儿童相关疾病的发病风险、疾病进展的标志物。目前越来越多研究通过检测动物模型体液8-OHdG水平，以探讨8-OHdG与相关疾病发生的关系。DNA氧化损伤标志物8-OHdG，已被用于临床解释退行性疾病、癌症和心血管疾病等的发病机制，在上述疾病的早期诊断和评价治疗效果等方面，也取得一定成效。 8-OHdG在儿童相关疾病的应用研究方面，尚处于起步阶段，有待更多基础、临床研究进一步探讨。
