探讨卵子玻璃化冷冻的临床应用可行性。
选择2011年7月至2016年5月，于江苏省苏北人民医院生殖医学中心采用玻璃化冷冻技术保存的卵子，进行卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)的13例患者，共计15个冷冻卵子ICSI周期为研究对象，纳入冷冻卵子组。选择同期于本院生殖医学中心进行新鲜卵子ICSI的252例患者，共计288个新鲜卵子ICSI周期作为对照，纳入新鲜卵子组。回顾性分析2组ICSI周期的临床病例资料，统计学比较2组受试者一般临床资料，受精情况及胚胎质量，以及临床妊娠结局。本研究遵循的程序符合江苏省苏北人民医院人体试验委员会制定的伦理学标准，得到该委员会批准，分组征得受试者知情同意，并与之签署临床研究知情同意书。
①2组患者的年龄、不孕年限、人体质量指数(BMI)、ICSI卵子数比较，差异均无统计学差异(P>0.05)。②冷冻卵子组中，卵子解冻后复苏存活率为87.1%(108/124)。冷冻卵子组卵裂率、优质胚胎率，均较新鲜卵子组显著降低，2组卵裂率与优质胚胎率分别为89.0%比98.2%与35.4%比50.7%，2组比较，差异均有统计学意义(χ2＝27.274，P<0.001；χ2＝5.871，P＝0.016)。2组正常受精率、可利用胚胎率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。③2组平均移植胚胎数比较，差异无统计学意义(P＝0.822)。冷冻卵子组体外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期的胚胎种植率、活产率，均显著低于新鲜卵子组IVF-ET周期，并且差异均有统计学意义(χ2＝5.534，P＝0.017；χ2＝7.005，P＝0.011)；2组IVF-ET周期的临床妊娠率、自然流产率分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。
卵子玻璃化冷冻、解冻后，再进行IVF-ET，可获得一定临床妊娠率，但卵子玻璃化冷冻技术仍会对卵子质量产生影响，进而影响胚胎质量和临床妊娠结局，此技术有待进一步改善。因本研究纳入样本量相对较小，卵子玻璃化冷冻技术保存的有效性，仍有待多中心、大样本、随机对照研究进一步证实。
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体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)治疗时，取卵日男方由于某种原因不能到场进行取精、睾丸穿刺取精失败或其他未预期的取精失败等发生时，为最大限度降低女方损失，需将卵子冷冻保存，待成功获取男方精子时，再将卵子解冻，进行IVF-ET。IVF-ET治疗中过剩卵子，亦可冷冻保存，IVF-ET治疗中待卵子受精失败或者未能成功妊娠后，再使用，以避免再次进行促排卵和取卵手术对患者的伤害；对于IVF-ET成功妊娠者，冻存卵子亦可用于将来不时之需，或者将冻存卵子捐赠给无可用卵子者。另外，冻存卵子还可为罹患盆腔肿瘤等可能导致失去卵巢功能的女性，保存生殖能力。全世界各生殖医学中心都在研究卵子冷冻保存技术，亦有将卵子冻融进行IVF-ET并且成功分娩的病例，但是卵子冻融进行IVF-ET的临床妊娠率差异较大，为2.5%～62.0%[1,2]。本研究对江苏省苏北人民医院生殖医学中心于2011年7月至2016年5月，应用玻璃化冷冻技术冷冻保存的卵子，卵子解冻后进行IVF-ET的妊娠结局进行回顾性分析，旨在为卵子玻璃化冷冻保存的临床应用可行性提供依据。现将研究结果报道如下。
选择2011年7月至2016年5月，于江苏省苏北人民医院生殖医学中心采用玻璃化冷冻技术保存的卵子，进行卵母细胞胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的13例患者，共计15个冷冻卵子ICSI周期为研究对象，纳入冷冻卵子组。其中，这13例患者的年龄为25～41岁，平均为(28.5±4.1)岁；不孕年限为1～14年。这15个冷冻卵子ICSI周期中，共计124个成熟卵子实施玻璃化冷冻、解冻，平均每个周期为(8.3±3.7)个。其中，13个周期为过剩卵子冷冻，1个周期为取卵日男方无活精子，1个周期为取卵日男方在外地无法到场进行取精。冷冻卵子组纳入标准：患者控制性超排卵取卵日未能获得可供利用的精子或卵子过多；取得的成熟卵子或过剩成熟卵子，采用玻璃化冷冻技术保存，待以后周期解冻后，进行ICSI。排除标准：补救ICSI周期。选择同期于本院生殖医学中心进行新鲜卵子ICSI的252例患者，共计288个新鲜卵子ICSI周期作为对照，纳入新鲜卵子组。其中，这252例患者的年龄为21～43岁，平均为(29.2±4.6)岁；不孕年限为1～20年。新鲜卵子组纳入标准：患者控制性超排卵取卵日进行ICSI；排除标准：补救ICSI周期。本研究遵循的程序符合江苏省苏北人民医院人体试验委员会制定的伦理学标准，得到该委员会批准，分组征得受试者知情同意，并与之签署临床研究知情同意书。
2组患者取卵周期，均采用长方案或短方案[3]超促排卵，在超声引导下经阴道取卵。卵子评价标准：于电子显微镜下观察卵子，若外观均匀透亮，无细胞质变色、卵细胞破裂或固缩，细胞质和透明带相连，无透明带断裂，则判断为存活卵子；若细胞质变性、变黑或固缩，或存在透明带断裂现象，则判断为受损卵子[4]。
冷冻卵子组患者取卵后，将卵子放于受精培养液(批号：505319，瑞士Vitrolife公司)中，置于37 ℃、6% CO2培养箱中培养2 h后，去除卵子外周颗粒细胞，将成熟卵子(电子显微镜下观察可见第一极体)进行玻璃化冷冻保存。玻璃化冷冻保存的具体操作步骤为：采用玻璃化冷冻试剂盒(批号：Y0847，日本Kitazato生物制药有限公司)，其冷冻液包括平衡液(equilibration solution，ES)和玻璃化冷冻液(vitrification solution，VS)，均于2～8 ℃保存，使用前取出，置于室温(23 ℃)下平衡处理30 min。采用吸卵管将卵子从培养液中吸出，置于ES表面，卵子自然下沉，于电子显微镜下观察卵子形状，卵子出现皱缩再恢复原形状(整个过程为5～10 min)时，将卵子放入VS中，约30 s后，再将卵子装载于全封闭载杆(法国Cryo Bio System公司)上，将载杆立即浸入液氮中使之迅速降温，并置于液氮罐中保存。
卵子玻璃化解冻的具体操作步骤为：采用玻璃化解冻试剂盒(批号：Z0872，日本Kitazato生物制药有限公司)，其解冻液包括孵育液、稀释液及洗脱液-1、-2，均于2～8 ℃保存。使用前，将孵育液于37 ℃条件下平衡30 min，稀释液及洗脱液-1、-2，均于室温下(23 ℃)平衡30 min。将装载冷冻卵子的全封闭载杆从液氮罐中取出，迅速放入孵育液中1 min，使卵子脱落于孵育液中，然后将卵子依次置于稀释液、洗脱液-1和洗脱液-2中各3 min，待卵子形态完全恢复后，将其转移至受精培养液中培养2～3 h。
将冷冻卵子期组解冻卵子及新鲜卵子组新鲜卵子，均进行ICSI，然后将卵子置于卵裂培养液(批号：505287，瑞士Vitrolife公司)中，培养18 h后，于Olympus IX71倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)下，观察卵子是否有原核形成、第二极体排出。若观察到卵子双原核和第二极体出现，则为正常受精；若观察到多原核或单原核，则为异常受精。每24 h观察1次胚胎卵裂情况，并进行胚胎质量评分。
根据取卵后第3天胚胎卵裂球大小是否一致、碎片率及细胞质颗粒现象，将胚胎分为4级[5]。Ⅰ级：卵裂球大小基本一致，碎片率≤5%，细胞质中无颗粒；Ⅱ级：卵裂球大小稍不一致，碎片率为>5%～20%，细胞质有少量颗粒现象；Ⅲ级：卵裂球大小明显不一致，碎片率为>20%～50%，细胞质中有明显颗粒现象；Ⅳ级：卵裂球大小极不一致，碎片率>50%，细胞质有严重颗粒现象。若胚胎发育速度过慢或过快，即取卵后第2天，卵裂球<3个或≥6个，以及取卵后第3天，卵裂球<6个或≥10个，则胚胎评分降一级。其中，Ⅰ～Ⅲ级胚胎为可利用胚胎，而Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎。
囊胚分级标准：根据Gardner评分系统，对囊胚进行分级，包括囊胚腔分期、内细胞团分级及滋养细胞层分级[6]。其中，囊胚腔分期(1～6期)：1期为囊胚腔<胚胎总体积的1/2；2期为囊胚腔≥胚胎总体积的1/2；3期为囊胚腔充满整个胚胎；4期为囊胚腔充满整个胚胎，并且胚胎总体积变大，透明带变薄；5期为囊胚部分从透明带中逸出；6期为囊胚全部从透明带中逸出。内细胞团分级(A～C级)：A级为细胞数目多，排列紧密；B级为细胞数目少，排列松散；C级为细胞数目极少。滋养层细胞分级(A～C级)：A级为上皮细胞层由较多的细胞组成，结构致密；B级为上皮细胞层由不多的细胞组成，结构松散；C级为上皮细胞层由稀疏的细胞组成。其中，评分≥4BC的囊胚，可予以冷冻保存或移植；评分≥4BB的囊胚，则判断为优质囊胚。
2组患者均采用激素替代周期或者自然周期方案[7]，进行子宫内膜准备。待患者子宫内膜准备好后，进行胚胎移植。
胚胎宫腔内移植14 d后，检测患者血清β-人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)水平，若血清β-hCG水平>20 IU/L，则判断为生化妊娠。胚胎宫腔内移植5周后，若超声检查见孕囊和胎心搏动，则判断为临床妊娠[1]。
采用Ssize软件，确定满足本研究统计检验的最小样本量。采用SPSS 16.0统计学软件包对本研究数据进行统计学处理。对患者年龄与人体质量指数(body mass index, BMI)等呈正态分布的计量资料，采用
±s表示，2组比较，采用t检验；对不孕年限等呈非正态分布的计量资料，采用M(P25～P75)表示，2组比较，采用Wilcoxon秩和检验。对于正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、可利用胚胎率等计数资料，采用率(%)表示，2组比较，采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
冷冻卵子组与新鲜卵子组患者的年龄、不孕年限、BMI、ICSI卵子数比较，差异均无统计学差异(P>0.05)。2组患者一般临床资料比较，见表1。
2组患者一般临床资料比较
2组患者一般临床资料比较
| 组别 | 周期数 | 年龄(岁， ±s) | 不孕年限[年，M(P25～P75)] | BMI(kg/m2， ±s) | ICSI卵子数[个，M(P25～P75)] |
|---|---|---|---|---|---|
| 冷冻卵子组 | 15 | 28.5±4.1 | 5.0(2.0～5.0) | 20.8±2.1 | 7.0(5.0～9.0) |
| 新鲜卵子组 | 288 | 29.2±4.6 | 3.0(2.0～6.0) | 21.9±3.1 | 9.0(5.0～13.0) |
| 检验值 | t＝－0.578 | Z＝－0.434 | t＝－1.124 | Z＝－1.381 | |
| P值 | 0.564 | 0.664 | 0.262 | 0.167 |
注：BMI为人体质量指数，ICSI为卵母细胞胞质内单精子注射
冷冻卵子组中，124个成熟卵子解冻复苏后，108个卵子存活，卵子复苏存活率为87.1%(108/124)。冷冻卵子组卵裂率、优质胚胎率，均较新鲜卵子组显著降低，2组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。2组正常受精率、可利用胚胎率分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。2组受精率及胚胎质量比较，见表2。
2组受精率及胚胎质量比较[%(n/n′)]
2组受精率及胚胎质量比较[%(n/n′)]
| 组别 | 周期数 | 正常受精率 | 卵裂率 | 优质胚胎率 | 可利用胚胎率 |
|---|---|---|---|---|---|
| 冷冻卵子组 | 15 | 67.6(73/108) | 89.0(65/73) | 35.4(23/65) | 76.9(50/65) |
| 新鲜卵子组 | 288 | 68.0(1 894/2 786) | 98.2(1 859/1 894) | 50.7(942/1 859) | 72.5(1 347/1 859) |
| χ2值 | 0.007 | 27.274 | 5.871 | 0.629 | |
| P值 | 0.917 | <0.001 | 0.016 | 0.482 |
注：n依次表示为正常受精卵子数、正常受精卵裂胚胎数、优质胚胎数、可利用胚胎数；n′依次表示为ICSI卵子数、正常受精卵子数、正常受精卵裂胚胎数、正常受精卵裂胚胎数。ICSI为卵母细胞胞质内单精子注射
冷冻卵子组共计进行17个胚胎移植周期，平均移植胚胎数为(1.8±0.6)个，新鲜卵子组共计进行256个胚胎移植周期，平均移植胚胎数为(1.8±0.5)个，2组平均移植胚胎数比较，差异无统计学意义(t＝0.225，P＝0.822)。冷冻卵子组胚胎移植周期的胚胎种植率、活产率，均显著低于新鲜卵子组胚胎移植周期，并且差异均有统计学意义(P<0.05)；2组胚胎移植周期的临床妊娠率、自然流产率分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。2组胚胎移植周期的胎儿畸形率均为0。
2组临床结局比较[%(n/n′)]
2组临床结局比较[%(n/n′)]
| 组别 | 胚胎移植周期数 | 胚胎种植率 | 临床妊娠率 | 活产率 | 自然流产率 |
|---|---|---|---|---|---|
| 冷冻卵子组 | 17 | 12.9(4/31) | 23.5(4/17) | 17.6(3/17) | 25.0(1/4) |
| 新鲜卵子组 | 256 | 33.3(153/460) | 46.9(120/256) | 50.8(130/256) | 16.7(20/120) |
| χ2值 | 5.534 | 3.505 | 7.005 | 0.191 | |
| P值 | 0.017 | 0.078 | 0.011 | 0.529 |
注：n依次表示为孕囊数、临床妊娠周期数、活产数、自然流产周期数；n′依次表示为移植胚胎数、胚胎移植周期数、胚胎移植周期数、临床妊娠周期数
人类卵子冻融技术，一直是生殖技术的难关，研究进展较为缓慢。卵子细胞器对温度等物理因素和化学因素的改变非常敏感，使得卵子在冷冻、解冻过程中极易受到损伤而凋亡，从而导致卵子冷冻保存效果较差。1986年，Chen[8]首次报道成功应用慢速程序化冷冻人类成熟卵子，并获双胎妊娠。1999年，Kuleshova等[9]首次成功应用玻璃化冷冻技术冷冻保存人类卵子。玻璃化冷冻技术是利用高浓度保护性溶液超快速降温，使卵子细胞在冷冻时呈现玻璃化状态，避免了慢速程序化冷冻过程中形成冰晶，而造成卵子细胞器等损伤，可更好地保存卵子细胞中的mRNA。
本研究结果显示，玻璃化冷冻卵子解冻后，卵子复苏存活率为87.1%(108/124)，这与Solé等[10] 报道的玻璃化冷冻卵子复苏率85.6%(847/989)相近。意大利Coticchio等[11]研究结果显示，卵子玻璃化冷冻、解冻后，其纺锤体和赤道染色体排列正常率为32.6%，低于新鲜卵子的59.1%。本研究冷冻卵子组与新鲜卵子组正常受精率、可利用胚胎率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；冷冻卵子组卵裂率、优质胚胎率，均较新鲜卵子组显著降低，2组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。这提示，卵子玻璃化冷冻，仍然会对卵子细胞的纺锤体、染色体等造成不同程度损伤。玻璃化冷冻、解冻卵子形成的胚胎，其质量及发育潜力降低，进而导致卵裂率和优质胚胎率降低，卵子玻璃化冷冻技术水平仍有待提高。文献报道，玻璃化冷冻卵子mRNA丢失率为36.7%，这可能是导致玻璃化冷冻卵子发育潜力降低的重要因素[12]。巴西Braga等[13]报道，425个供卵周期均为玻璃化冷冻卵子，卵子解冻进行ICSI后，形成2 128个胚胎，与新鲜卵子组胚胎相比，玻璃化冷冻卵子组胚胎的发育潜力低下，其受精率、胚胎质量和囊胚形成率均较低，而且胚胎种植率和临床妊娠率，也低于新鲜卵子组冻融胚胎移植周期[13]。冷冻卵子解冻后受精形成的胚胎，若采用人工周期或自然周期方案准备好子宫内膜后，再将其移植到"更易接受的子宫内膜" ，无促性腺激素的不良影响，则其临床妊娠率和胚胎着床率，均高于新鲜卵子组新鲜胚胎移植周期[13]。在辅助生殖技术治疗过程中，由于大剂量促性腺激素的应用，子宫内膜容受性受损，导致胚胎与子宫内膜发育不同步。冻融胚胎周期应用人工周期或自然周期方案准备子宫内膜，避免了大剂量促性腺激素的使用，子宫内膜更接近自然妊娠状态。文献报道，与新鲜胚胎移植周期组相比，冻融胚胎移植周期组具有较高胚胎着床率和临床妊娠率[14,15]。
本研究结果显示，2组胚胎移植周期的临床妊娠率、自然流产率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。但是，冷冻卵子组胚胎移植周期的胚胎种植率、活产率，均低于新鲜卵子组胚胎移植周期，并且差异均有统计学意义(P<0.05)。分析其原因，可能为玻璃化冷冻技术对卵子造成损伤，导致优质胚胎率降低，进而影响胚胎种植率和活产率的缘故。
由于开放式玻璃化冷冻载杆存在污染的风险，近年来封闭式玻璃化冷冻载杆逐渐应用于临床。美国Gook等[16]研究结果显示，人类卵子使用封闭式玻璃化冷冻载杆冷冻保存的存活率为89.7%(35/39)，与开放式玻璃化冷冻载杆冷冻保存的存活率92.4%(73/79)相似。文献报道，冷冻囊胚与新鲜囊胚进行胚胎移植的胚胎种植率比较，差异无统计学意义[16]。比利时De Munck等[17]研究比较了封闭式玻璃化冷冻载杆与开放式玻璃化冷冻载杆冷冻保存人类卵子的效果，解冻卵子的复苏存活率(93.7%与89.9%)、受精率(74.3%与81.4%)及优质胚胎率(66.5%与66.5%)分别比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。由此可见，封闭式玻璃化冷冻载杆冷冻保存卵子的效果与开放式玻璃化冷冻载杆相似。
综上所述，成熟卵子玻璃化冷冻保存，经解冻后，再进行IVF-ET，可获得一定临床妊娠率，但卵子玻璃化冷冻仍会对卵子质量产生影响，进而影响胚胎质量和临床妊娠结局，此技术有待进一步改善。由于本研究纳入样本量相对较小，卵子玻璃化冷冻技术保存的有效性，仍有待多中心、大样本、随机对照研究进一步研究、证实。
