探究过表达滋养细胞中乙酰肝素酶(HPSE)对细胞因子表达的影响，并且初步预测HPSE对滋养细胞作用的潜在分子机制。
选择早孕期人绒毛膜滋养细胞株HTR8/SVneo为研究对象，并构建HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株，纳入检验组，以及HPSE正常表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株，纳入对照组。采用细胞因子抗体芯片半定量检测，对检验组和对照组滋养细胞株中343种细胞因子的变化情况进行检测。应用Image J软件分析和找出差异细胞因子蛋白。采用Western blotting检测2组滋养细胞株中表达水平差异最大的细胞因子AXL受体酪氨酸激酶表达水平，以验证细胞因子抗体芯片半定量检测结果。通过STRING蛋白数据库构建蛋白相互作用关系网络，并应用The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)在线生物信息学分析软件，进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析。
①细胞因子抗体芯片半定量检测结果显示，与对照组滋养细胞株相比，检验组滋养细胞株过表达HPSE后，其细胞因子表达下降，并且检验组与对照组滋养细胞株中细胞因子蛋白表达水平比值<0.666 7的细胞因子，即差异细胞因子共计15种，分别为AXL、细胞间黏附分子(ICAM)1、TEK受体酪氨酸激酶、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(PLAUR)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)2、基质金属蛋白酶(MMP)9、淋巴细胞激活基因(LAG)3、肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)1B、TNFRSF1A、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、TIMP4、人血小板反应蛋白(THBS)1、白细胞介素17受体B(IL17RB)、连接黏附分子样蛋白(AMICA)及C-C类趋化因子16(CCL16)。②Western blotting检测结果显示，检验组滋养细胞株中AXL蛋白表达水平明显低于对照组滋养细胞株，并且差异有统计学意义(t＝－6.931，P＝0.020)，这与细胞因子抗体芯片半定量检测结果一致。③通过STRING蛋白数据库分析结果发现，HPSE可通过血管内皮生长因子(VEGF)A，肿瘤蛋白p53(TP53)和CD44与MMP9产生关联，而MMP9又可直接或者间接与除LAG3、CCL16和IL17RB之外的其他12种差异细胞因子相关联，从而建立相互作用关系网络图。④细胞因子GO功能富集分析结果发现，差异细胞因子主要涉及细胞凋亡负调控和细胞外基质(ECM)分解等41个生物学过程。KEGG信号通路分析结果显示，差异细胞因子主要涉及癌症蛋白多糖信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等6条信号通路。
过表达HPSE可调控滋养细胞中细胞因子的表达，可能通过MMP9参与的癌症蛋白多糖信号通路影响滋养细胞的生物学功能。本研究结果可为后续研究HPSE对滋养细胞相关疾病影响，提供研究方向和研究基础。
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成功妊娠和母体与胎儿之间复杂的相互作用密切相关。在早孕期，滋养细胞具有"恶性肿瘤"特性，侵袭子宫肌层，取代子宫螺旋动脉，从而形成胎盘，为胎儿的正常发育提供营养物质[1]。为保证胎盘的正常发育，滋养细胞的生物学行为在时间和空间上受到严格控制，而且对其调控机制迄今尚未完全阐明[2]。若该调控功能失去平衡，则可使滋养细胞的侵袭能力减弱，从而导致子痫前期或胎儿生长受限等妊娠期相关疾病[3]；而滋养细胞过度地侵袭，则可能引起胎盘黏连或滋养细胞肿瘤[4]。研究结果发现，胎盘滋养细胞中细胞因子的表达，可影响滋养细胞的侵袭等生物学行为[5,6,7]，但是引起细胞因子发生变化的潜在机制，迄今尚众说纷纭。
乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是哺乳动物细胞中唯一被发现的一种内生性β-葡萄糖醛酸苷酶，可特异性水解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)的硫酸乙酰肝素侧链[8]。文献报道，恶性肿瘤组织中高表达的HPSE，可通过调控细胞因子表达，从而使肿瘤组织的侵袭能力增强[9]。HPSE也可调节转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β的表达和活性，在肾脏纤维化中起着关键作用[10]。同时，Lv等[11]研究结果发现，在胰腺导管细胞腺癌中，HPSE可调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。由此可见，HPSE可调节细胞因子的表达。在前期研究中，本课题组采用免疫组织化学和蛋白质印迹法(Western blotting)检测结果发现，HPSE在子痫前期孕妇胎盘滋养细胞中的表达和定位，与正常孕妇相比较，差异有统计学意义(P<0.05)[12]。这表明，HPSE与滋养细胞的生物学功能相关，但是HPSE是否影响滋养细胞中细胞因子的表达，目前尚未见相关文献报道。本研究首次对HPSE调控滋养细胞中细胞因子表达及其对滋养细胞作用的潜在分子机制进行探讨，旨在为后续研究HPSE对滋养细胞生物学功能及滋养细胞相关疾病的影响，提供研究方向和研究基础。现将研究结果报道如下。
选择早孕期人绒毛膜HTR8/SVneo滋养细胞株为研究对象，并构建HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株，纳入检验组，以及HPSE正常表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株，纳入对照组。HTR8/SVneo滋养细胞株由四川大学华西第二医院妇产科周容教授团队馈赠。
胎牛血清(批号：RB35934，美国Hyclone公司)；RPMI 1640培养基(批号：AB10190291，美国Hyclone公司)；胰酶(批号：J170019，美国Hyclone公司)；嘌呤霉素(批号：419E0426，北京索莱宝生物科技有限公司)；青链霉素溶液(批号：J150001，美国Hyclone公司)；聚凝胺(批号：H9268，美国Sigma公司)；人细胞因子抗体芯片C系列4000试剂盒(RayBio® C-Series Human Cytokine Antibody Array C4000，批号：619157038，美国RayBiotech公司)；BCA试剂盒(批号：OL197508，美国Thermo公司)；ECL底物试剂盒(批号：1619502，美国Millipore公司)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(批号：K0NA1684RK，美国Millipore公司)；鼠抗人β-actin单克隆抗体(批号：PD0208，成都正能生物技术有限责任公司)；兔抗人AXL受体酪氨酸激酶多克隆抗体(批号：13196-1-AP，武汉三鹰生物技术有限公司)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G抗体(批号：112971，北京中杉金桥生物技术有限公司)；HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(批号：109525，北京中杉金桥生物技术有限公司)。ChemiDoc™ Touch Imaging System(美国BioRad公司)，倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)。
早孕期人绒毛膜HTR8/SVneo滋养细胞株培养步骤如下：将HTR8/SVneo滋养细胞株置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5% CO2培养箱内，隔日传代培养。传代时，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按照1∶3或1∶4的细胞稀释比例传代培养。
通过正向引物5′-TGAACCGTCAGATCGAATTCGCCACCATGC TGCTGCGCTCGAAG-3′和反向引物5′-TCATC C T T G T A G T C G A A T T C G A T G C A A G C A G C A A C TTTGG-3′扩增，获得HPSE目标片段，将HPSE目标片段构建入慢病毒载体(pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro)，采用巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子启动目的基因的下游表达，得到HPSE过表达载体。该载体可在干扰目的基因的同时携带嘌呤霉素抗性基因，前者便于观察慢病毒载体工作状态，后者有利于筛选目的基因干扰的稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株。
对HPSE过表达慢病毒载体和过表达空载体转染HTR8/SVneo滋养细胞株，加入5 μg/mL聚凝胺进行培养，培养20 h后更换培养基，再加入2 μg/mL嘌呤霉素进行细胞筛选，平均每2～3 d更换一次含2 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基，对细胞持续筛选2周。
当HTR8/SVneo滋养细胞株细胞生长至融合度为80%时，去除培养基，采用预冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，再加入含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，置于4 ℃摇床上摇晃裂解30 min后，于4 ℃条件下以14 000×g离心10 min，取上清液，采用BCA试剂盒进行细胞因子总蛋白定量检测。严格按照试剂盒说明书操作，采用人细胞因子抗体芯片C系列4000试剂盒半定量检测滋养细胞株中的343种细胞因子蛋白表达情况。然后，采用Image J软件检测每种细胞因子、阳性对照点和阴性对照点的灰度值。其中，阳性对照点灰度值用于细胞因子蛋白半定量检测结果的标准化，即各点灰度值与阳性对照点灰度值的比值表示各点标准化灰度值，再将检验组与对照组各点标准化灰度值的比值，表示各点代表的细胞因子蛋白表达升高或者降低情况。若检验组与对照组标准化灰度值比值>1.50，则表示该细胞因子蛋白高表达；若检验组与对照组标准化灰度值比值<0.666 7，则表示该细胞因子蛋白低表达。阴性对照点灰度值，用于评估细胞因子抗体芯片经人细胞因子抗体芯片C系列4000试剂盒自带封闭液封闭后的非特异性结合位点的非特异性结合水平。
采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳，对总蛋白进行分离，然后将总蛋白转移至PVDF膜上。采用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭PVDF膜上的非特异性结合位点后，加入1∶1 000稀释的兔抗人AXL受体酪氨酸激酶多克隆抗体4 ℃孵育过夜，采用TBST溶液洗膜3次后，再加入1∶3 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体室温孵育1 h，采用TBST溶液洗膜3次，最后加入ECL化学发光液进行显色，检测AXL蛋白表达情况。按照上述步骤，封闭PVDF膜上的非特异性结合位点后，分别加入1∶3 000稀释的鼠抗人β-actin单克隆抗体及1∶3 000稀释的HRP-山羊抗鼠IgG抗体检测β-actin表达情况，验证细胞因子抗体芯片半定量检测结果。对检验组和对照组HTR8/SVneo滋养细胞株AXL蛋白，均分别进行3次Western blotting检测，取3次检测结果的平均值作为最终检测结果。
将HPSE和细胞因子抗体芯片半定量检测结果中表达下降的细胞因子，同时提交至STRING蛋白数据库(https：//string-db.org)，对每种细胞因子蛋白相关文献进行挖掘，自动获取可视化细胞因子蛋白相互作用网络。
将细胞因子抗体芯片半定量检测结果中表达下降的细胞因子提交至The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)在线生物信息学分析软件，进行基因本体(gene ontology，GO)生物功能分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路分析，预测表达下降的细胞因子涉及的主要生物学功能及信号通路。
本研究数据采用GraphPad Prism 5.02软件进行统计学分析。对于呈正态分布的细胞因子蛋白半定量检测结果，采用
±s表示，2组比较，采用成组t检验。所有统计学检验采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
细胞因子抗体芯片半定量检测结果发现，HPSE过表达的检验组滋养细胞株中，细胞因子蛋白表达下降，并且检验组与对照组滋养细胞株中细胞因子蛋白表达水平比值<0.666 7的细胞因子，即差异细胞因子共计15种，即AXL，细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)1，TEK受体酪氨酸激酶(TEK receptor tyrosine kinase)，尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase-type plasminogen activator receptor，PLAUR)，金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)2，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9，淋巴细胞激活基因(lymphocyte-activation gene，LAG)3，肿瘤坏死因子受体超家族成员(tumor necrosis factor receptor superfamily，TNFRSF)1B、1A，细胞毒性和调节性T细胞分子(cytotoxic and regulatory T cell molecule，CRTAM)，TIMP4，人血小板反应蛋白(human platelet reactive protein，THBS)1，白细胞介素17受体B(interleukin 17 receptor B，IL17RB)，连接黏附分子样蛋白(junctional adhesion molecule-like protein，AMICA)，以及C-C类趋化因子16(C-C chemotactic factor 16，CCL16)。本次细胞因子抗体芯片半定量检测未发现检验组与对照组滋养细胞株细胞因子蛋白表达水平比值>1.50的细胞因子。细胞因子抗体芯片半定量检测结果，见表1和图1。
细胞因子蛋白的细胞因子抗体芯片半定量检测结果分析
细胞因子蛋白的细胞因子抗体芯片半定量检测结果分析
| 细胞因子编号 | 蛋白名称 | 缩略词 | 变化情况 |
|---|---|---|---|
| 1 | AXL受体酪氨酸激酶 | AXL | 0.560 8 |
| 2 | 细胞间黏附分子1 | ICAM1 | 0.585 4 |
| 3 | TEK受体酪氨酸激酶 | TEK | 0.586 0 |
| 4 | 尿激酶型纤溶酶原激活物受体 | PLAUR | 0.591 0 |
| 5 | 金属蛋白酶组织抑制因子2 | TIMP2 | 0.603 7 |
| 6 | 基质金属蛋白酶9 | MMP9 | 0.609 1 |
| 7 | 淋巴细胞激活基因3 | LAG3 | 0.615 8 |
| 8 | 肿瘤坏死因子受体超家族成员1B | TNFRSF1B | 0.616 0 |
| 9 | 肿瘤坏死因子受体超家族成员1A | TNFRSF1A | 0.641 6 |
| 10 | 细胞毒性和调节性T细胞分子 | CRTAM | 0.652 8 |
| 11 | 金属蛋白酶组织抑制因子4 | TIMP4 | 0.656 2 |
| 12 | 人血小板反应蛋白1 | THBS1 | 0.659 6 |
| 13 | 白细胞介素17受体B | IL17RB | 0.659 8 |
| 14 | 连接黏附分子样蛋白 | AMICA | 0.661 3 |
| 15 | C-C类趋化因子16 | CCL16 | 0.666 5 |
注：变化情况表示检验组与对照组细胞株细胞因子蛋白表达水平比值
注：pLenti-HPSE-HTR8为HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株(检验组)，pLenti-HTR8为HPSE正常表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株(对照组)。图中1～15分别表示：AXL、ICAM1、TEK、PLAUR、TIMP2、MMP9、LAG3、TNFRSF1B、TNFRSF1A、CRTAM、TIMP4、THBS1、IL17RB、AMICA和CCL16。C6～C12分别表示细胞因子抗体芯片编号。AXL为AXL受体酪氨酸激酶，ICAM1为细胞间黏附分子1，TEK为TEK受体酪氨酸激酶，PLAUR为尿激酶型纤溶酶原激活物受体，TIMP为金属蛋白酶组织抑制因子，MMP9为基质金属蛋白酶9，LAG3为淋巴细胞激活基因3，TNFRSF为肿瘤坏死因子受体超家族成员，CRTAM为细胞毒性和调节性T细胞分子，THBS1人血小板反应蛋白1，IL17RB为白细胞介素17受体B，AMICA为连接黏附分子样蛋白，CCL16为C-C类趋化因子16
为了验证细胞因子抗体芯片对细胞因子蛋白的半定量检测结果，分别采集检验组和对照组细胞株的细胞因子蛋白，采用Western blotting检测表达下降最为显著的AXL蛋白。Western blotting检测结果显示，检验组细胞株中AXL蛋白表达水平明显低于对照组细胞株，并且差异有统计学意义(t＝－6.931，P＝0.020)，见图2。这与细胞因子抗体芯片半定量检测结果一致。
注：细胞因子抗体芯片采用的是双抗夹心原理对细胞因子蛋白表达情况进行检测。在前期研究中，本课题组曾多次使用本研究中的细胞因子抗体芯片进行检测，所有具有表达差异的细胞因子均得到了很好的验证，说明该细胞因子抗体芯片检测准确度较高。因此，本研究中仅对2组表达水平差异最大的AXL蛋白采用Western blotting进行检测，以验证细胞因子抗体芯片半定量检测结果。a表示检验组vs对照组：P＝0.020。pLenti-HPSE-HTR8为HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株(检验组)，pLenti-HTR8为HPSE正常表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株(对照组)。Western blotting为蛋白质印迹法
为了确定HPSE与15种差异细胞因子的相互作用关系，将这16种蛋白(HPSE、AXL、ICAM1、TEK、PLAUR、TIMP2、MMP9、LAG3、TNFRSF1B、TNFRSF1A、CRTAM、TIMP4、THBS1、IL17RB、AMICA、CCL16)提交至STRING蛋白数据库进行在线分析，构建产生包含16个节点和18条边的蛋白相互作用网络分布图发现，HPSE与上述15种细胞因子间未存在直接关联，但是MMP9可同时与其中8种细胞因子产生直接关联；继续挖掘数据，构建产生含66个节点和566条边的蛋白相互作用网络分布图发现，HPSE可通过VEGFA，肿瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)和CD44这3个关键分子与MMP9相关联，而除LAG3、CCL16和IL17RB之外的其他12种差异细胞因子，亦可与MMP9产生直接或间接关联，从而与HPSE产生间接关系，见图3。
注：1、2、3、4、5分别表示MMP9、HPSE、VEGFA、CD44和TP53所在位置。HPSE为乙酰肝素酶，MMP为基质金属蛋白酶，VEGFA为血管内皮生长因子A，TP53为肿瘤蛋白p53，AXL为AXL受体酪氨酸激酶，ICAM为细胞间黏附分子，TEK为TEK受体酪氨酸激酶，PLAUR为尿激酶型纤溶酶原激活物受体，TIMP为金属蛋白酶组织抑制因子，LAG3为淋巴细胞激活基因3，TNFRSF为肿瘤坏死因子受体超家族成员，CRTAM为细胞毒性和调节性T细胞分子，THBS1人血小板反应蛋白1，IL17RB为白细胞介素17受体B，AMICA为连接黏附分子样蛋白，CCL16为C-C类趋化因子16, ITGAL为整合素α亚基L，ITGAX为整合素α亚基X，CXADR为免疫球蛋白样细胞黏附分子，ITGB为整合素β亚基，ITGAM为整合素α亚基M, NFKB1为核因子-κB1，MAP3K7为丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7，TAB2为MAP3K7结合蛋白2，TRADD为通过死亡结构域TNFRSF1A关联，RIPK1为受体相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶1，TNF为肿瘤坏死因子，TRAF为TNF受体相关因子，IKBKB为核因子-κB激酶β亚基抑制剂，IKBKG为核因子-κB激酶γ亚基抑制剂，BIRC2为杆状病毒IAP重复序列包含蛋白2，BIRC3为杆状病毒IAP重复序列包含蛋白3，FADD为通过死亡域关联的Fas，LTA为淋巴毒素α，LTBR为淋巴毒素β受体，CASPB为半胱天冬酶B，IL1B为白细胞介素1B，JUN为jun原癌基因，TGFB1为转化生长因子B1，PLG为纤溶酶原，GAS6为生长停滞特异因子6，MERTK为MER原癌基因酪氨酸激酶，SERPINB2为丝氨酸蛋白酶抑制剂B2，SERPINE1为丝氨酸蛋白酶抑制剂E1，COL18A1为十八型胶原α1链，ANGPT为血管生成素，IL25为白细胞介素25
细胞因子GO功能富集分析结果显示，差异细胞因子主要涉及炎症反应、细胞凋亡、血管生成、白细胞迁移及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的生成和分解等41个生物学过程。进行KEGG信号通路分析的结果显示，差异细胞因子主要涉及的信号通路是蛋白多糖信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等6条信号通路。其中，MMP9主要参与ECM分解和细胞凋亡负调控的生物学过程及蛋白多糖信号通路，见图4。其中，细胞因子GO生物学功能分析的41个生物学过程分别为：蛋白激酶B信号正调控(positive regulation of protein kinase B signaling)，白细胞迁移(leukocyte migration)，通过质膜细胞黏附分子的异嗜性细胞黏附(heterophilic cell-cell adhesion via plasma membrane cell adhesion molecules)，对药物反应(response to drug)，炎症反应正调控(positive regulation of inflammatory response)，膜蛋白胞外结构域水解负调控(negative regulation of membrane protein ectodomain proteolysis)，参与凋亡信号通路的半胱氨酸型内肽酶活性的负调控(negative regulation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic signaling pathway)，凋亡负调控(negative regulation of apoptotic process)，细胞对肿瘤坏死因子的反应(cellular response to tumor necrosis factor)，蛋白磷酸化正调控(positive regulation of protein phosphorylation)，排卵周期(ovulation cycle)，炎症反应(inflammatory response)，免疫应答调控(regulation of immune response)，细胞外信号调节激酶1和2级联反应正调控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)，凝血功能正调控(positive regulation of blood coagulation)，细胞外基质的组成(extracellular matrix organization)，正调控自然杀伤细胞介导的细胞毒性(positive regulation of natural killer cell mediated cytotoxicity)，内源性凋亡信号通路负调控(negative regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway)，出芽式血管生成(sprouting angiogenesis)，内皮生长因子受体信号通路正调控(positive regulation of epidermal growth factor receptor signaling pathway)，正调控线粒体细胞色素c的释放(positive regulation of release of cytochrome c from mitochondria)，DNA结合正调控(positive regulation of DNA binding)，内皮细胞凋亡负调控(negative regulation of endothelial cell apoptotic process)，底物黏附依赖性细胞扩散(substrate adhesion-dependent cell spreading)，对肽类激素的应答(response to peptide hormone)，内皮细胞迁移正调控(positive regulation of endothelial cell migration，对细胞因子的应答(response to cytokine)，免疫应答(immune response)，血管生成负调控(negative regulation of angiogenesis)，中性粒细胞的趋化作用(neutrophil chemotaxis)，白细胞介素-1的细胞应答(cellular response to interleukin-1)，病毒进入宿主细胞(viral entry into host cell)，细胞外基质分解(extracellular matrix disassembly)，信号传导(signal transduction)，炎症反应负调控(negative regulation of inflammatory response)，GTP酶活性正调控(positive regulation of GTPase activity)，趋化作用(chemotaxis)，内肽酶活性负调控(negative regulation of endopeptidase activity)，血管生成正调控(positive regulation of angiogenesis)，细胞对脂多糖的反应(cellular response to lipopolysaccharide)，中枢神经系统发育(central nervous system development)。KEGG信号通路分析的6条信号通路分别涉及：癌症蛋白多糖(proteoglycans in cancer)，肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)，膀胱(bladder cancer)，疟疾(malaria)，核因子-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)。
注：图4A中长方形的颜色代表所对应的P值。图4B中圆圈大小表示参与信号通路的基因数量，圆圈越大表示参与信号通路的基因越多；圆圈的颜色代表所对应的P值。GO为基因本体，KEGG为京都基因与基因组百科全书
细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子糖蛋白，其在免疫系统中发挥着重要作用，如细胞间信号传导，调节细胞的生长、分化，调控免疫应答，介导机体的炎症反应等[13]。研究结果发现，错综复杂的细胞因子网络和细胞因子间相互作用，还可参与妊娠相关的排卵、胚胎植入、胎盘形成和分娩等胎儿胎盘发展过程[14]。正常妊娠被认为是一种可控的、适度的炎症反应[15]，其中白细胞介素(interleukin，IL)-10有利于正常妊娠，IL-10基因多态性导致的IL-10缺陷与子痫前期发病风险相关[16,17]。而与此相反，异常妊娠如子痫前期，则是一种不可控的级联放大炎症反应[15]，文献报道，TGF-β不仅可促进滋养细胞凋亡和坏死[18]，还可抑制滋养细胞的侵袭能力[19]。虽然在滋养细胞相关疾病中，细胞因子发挥着重要作用，但是引起细胞因子发生变化的原因，迄今尚不完全清楚。
HPSE是目前发现的在哺乳动物体内唯一的内生性β-葡萄糖醛酸苷酶，可特异性水解硫酸乙酰肝素侧链，参与ECM生成与分解、炎症、血管生成和癌症进展[20]。在前期研究中，本课题组通过免疫组织化学检测结果发现子痫前期患者胎盘中，HPSE的表达和定位不同于正常孕妇胎盘[12]；为了初步探讨在滋养细胞中HPSE与细胞因子间的关系，本研究选择早孕期人滋养细胞株HTR8/SVneo作为研究对象，构建HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株，通过细胞因子抗体芯片半定量检测结果发现，HPSE高表达可降低滋养细胞AXL、ICAM1、TEK、PLAUR、TIMP2、MMP9、LAG3、TNFRSF1B、TNFRSF1A、CRTAM、TIMP4、THBS1、IL17RB、AMICA和CCL16的表达。然后，本研究将HPSE与差异细胞因子通过STRING蛋白数据库进行相互作用关系分析的结果发现，HPSE可通过VEGFA、TP53和CD44这3个关键分子与MMP9相关联，而MMP9又可通过直接或者间接关联，与其他细胞因子建立联系，这表明MMP9调节蛋白相互作用功能最强，为蛋白相互作用的核心细胞因子。Luan等[21]研究结果发现，在黑色素瘤中，HPSE和VEGF可相互调节，促进肿瘤细胞生长、转移和血管生成，从而抑制肿瘤细胞凋亡。HPSE也可调控VEGF的表达，从而促进胰腺导管细胞腺癌的侵袭能力[11]。TP53作为一种肿瘤抑制蛋白，可与HPSE基因启动子相结合，下调HPSE的表达[22]。CD44是一种细胞表面糖蛋白，参与细胞与细胞间的相互作用、细胞黏附和迁移，也可与其他配体相互作用，如MMP可参与ECM的分解[23,24]。亦有文献报道，通过调控MMP9[25,26]和TIMP[27]的表达，可影响滋养细胞的迁移和侵袭能力。因此，MMP及其组织因子抑制物的表达不平衡，是影响滋养细胞侵袭能力和生物学功能的重要因素，对子痫前期和妊娠相关疾病的发生、发展起着重要作用[28]。
本研究GO功能分析结果显示，检验组与对照组滋养细胞株细胞因子蛋白表达水平比值<0.666 7的15种细胞因子主要涉及炎症反应、凋亡、血管生成、白细胞迁移及ECM的生成、分解等41个生物学过程；KEGG信号通路分析结果显示，这15种细胞因子主要涉及的信号通路是蛋白多糖信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等6条信号通路，其中蛋白多糖信号通路为细胞因子参与数量最多的信号通路，而MMP9主要参与ECM分解和细胞凋亡负调控的生物学过程及蛋白多糖信号通路。因此，该信号通路可能为HPSE影响滋养细胞生物学功能的主要信号通路。在肿瘤微环境中，许多蛋白聚糖已被证明是导致各种癌症的关键分子，在肿瘤细胞增殖、黏附、血管生成和转移中发挥重要作用，影响肿瘤进展。蛋白多糖主要分为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HPSG)，硫酸软骨素蛋白多糖，硫酸软骨素蛋白聚糖和硫酸角质素蛋白多糖4种类型。这些多糖可与CD44相互作用，促进肿瘤细胞的生长和迁移[29,30]，又因为HPSE可调控HPSG的分解和再结合，从而影响ECM的生成和分解，促进肿瘤细胞增殖、侵袭和血管生成[31,32,33]。
综上所述，本研究首次发现HPSE可调控滋养细胞中细胞因子的表达。过表达HPSE可能通过调控MMP9表达，参与蛋白多糖信号通路，导致ECM的分解和细胞凋亡负调控，从而影响滋养细胞的生长和迁移等生物学功能，但是其具体的作用及机制仍有待进一步研究。本研究结果可为后续研究HPSE对滋养细胞相关疾病的影响，提供研究方向和研究基础。
