随着男性不育症发病率的升高，精液常规检测已不足以精确评估男性生育力。近年来，精子DNA损伤检测作为一项评估精子质量及男性生育力更精准的指标，逐步成为生殖医学领域的研究热点。精子DNA损伤的机制包括精子发生异常、氧化应激损伤、精子凋亡异常等。目前，精子染色质结构分析法(SCSA)已经成为检测精子DNA完整性的金标准。精子DNA损伤可能与男性不育、辅助生殖结局及后代生长、发育相关。笔者拟就精子DNA损伤的机制、检测方法、对男性生育力的影响及其与辅助生殖技术的关系进行综述，旨在为男性不育症的临床诊断提供依据。
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在不孕不育的病因中，既往研究更多关注女性因素，但是导致不孕不育的病因中约50%为男性因素，并且约15%男性不育患者的精液常规检查结果显示参数正常[1]，这为男性生育力的评估造成了困扰。虽然精液常规检测是评估男性生育力的重要手段，但是容易受到外界环境、操作员等主、客观因素影响。越来越多研究证明精液常规检测已不足以精确评估男性生育力[2]。近年，精子DNA损伤检测作为精液常规检测的补充，是一项新的预测男性生育力的指标。但是，影响精子DNA损伤的原因较多，包括年龄、生殖系统疾病、肿瘤放化疗、吸烟等，精子DNA损伤机制也较复杂，精子DNA损伤的检测方法较多，并且目前尚无统一标准。笔者拟就精子DNA损伤的相关研究进展及其对辅助生殖结局的影响进行综述如下。
精子发生是指精原干细胞经过一系列复杂的分化和发育最终生成精子的过程。精子发生过程中，成熟精子的核DNA与鱼精蛋白紧密结合，高度浓缩，抑制基因表达，保持遗传物质稳定。鱼精蛋白可促进DNA浓缩，使基因组DNA包装成微小的精子头，是产生精子功能的本质。若精子发生过程中组蛋白与鱼精蛋白转化过程发生障碍，则会引起精子染色质结构异常。Gou等[3]研究结果显示，人类PIWI基因缺失、突变可导致组蛋白异常保留，引起组蛋白与鱼精蛋白转化过程障碍，导致男性不育。PIWI亚家族主要有3个成员，分别为MIWI、MILI和MIWI2，可维持晚期精母细胞遗传物质的稳定。动物实验结果表明，敲除小鼠miwi、mili或miwi2基因，会导致小鼠精子发生明显缺陷，表现为雄性不育[4,5]。
正常情况下，生殖系统中活性氧的产生和清除处于稳定状态，少量活性氧是调节精子正常功能所必需的，如精子获能、顶体反应、精卵正常结合等[6]。但是，在某些内外环境影响下引起精子氧化与抗氧化系统间失衡时，过多的活性氧不能及时被清除，高浓度的活性氧与脂质、蛋白质和DNA分子相互作用，引起DNA断裂损伤，精子抗氧化活性降低等，最终导致精子发生异常。精子及精子发生过程易受活性氧攻击的原因有：①精子染色质浓缩时期敏感度高；②精子细胞没有DNA修复机制；③精子膜含有高浓度的多不饱和脂肪酸；④精子自身产生的活性氧，尤其精子通过附睾时产生的活性氧；⑤具有低水平的细胞内抗氧化酶(多数的抗氧化酶在精子发生过程中丢失)；⑥精子的表型及活性受女性生殖道解剖结构或者受精环境(顶体反应过程)的影响，即女性的生殖道环境的改变对精子的存活及能否受精成功有优势选择的作用[7,8,9,10,11]。
生理情况下，细胞凋亡是指细胞的生理性主动死亡，凋亡机制的调节失衡是许多疾病的根源。精子细胞的正常凋亡对调控精子数量、及时清除体内染色体异常的精子和维持精子质量有重要作用，精子发生过程中25%～75%精子细胞通过凋亡程序被破坏。阳方等[12]研究结果表明，生精细胞的早期凋亡主要通过生精细胞和支持细胞表面表达的Fas/Fas配体来调控。睾丸发生病理改变时，可出现Fas/Fas配体系统表达异常。这与Lee等研究结果一致[13]。此外，精子的"凋亡逃逸"可能会使具有DNA损伤的生精细胞逃避某些凋亡途径，并进一步分化为携带损伤DNA的成熟精子[14]。虽然这些异常的精子与卵子可正常受精，但胚胎发育至4～8细胞期时，损伤的DNA将会诱导胚胎发生凋亡、囊胚形成率降低，引起胚胎发育异常、早期流产甚至异常缺陷等概率增高。
精子染色质结构分析法(sperm chromatin structure assay，SCSA)于1980年提出，利用吖啶橙的染色质特异性来检测存在DNA损伤的精子与正常精子[15]，其原理是正常双链DNA紧密结合具有稳定性及抗酸性，而受损伤的精子DNA染色质结构比较疏松，容易被酸性物质作用变性成单链。吖啶橙与双链DNA结合成单体发出绿色荧光，而与单链DNA结合成聚合物时会发出红色或黄色荧光。流式细胞仪可检测吖啶橙与精子DNA结合发出的荧光，最后由计算机软件处理得出SCSA参数(DNA片段指数和高DNA可染性)。在良好的质控下，SCSA是一种可重复性高，变异率低于2%的方法，并且不同实验室获得的结果具有很高的可比性[16]。该方法已经成为检测精子DNA损伤的金标准。
末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)介导的带荧光的脱氧三磷酸鸟苷缺口末端标记技术(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)由异硫氰荧光素(fluorescein isothiocynate，FITC)作为标志物，主要用于特异性检测精子细胞凋亡引起的DNA损伤，灵敏度高，可以量化分析DNA损伤。其原理是凋亡细胞的核DNA被激活的内源性核酸内切酶切割成双链DNA片段和高分子量DNA单链缺口，从而暴露出大量3-OH末端，然后通过脱氧核苷酸末端转移酶将带有标记的核苷酸转移至3-OH末端，结果可通过流式细胞仪、荧光或光学显微镜来评估精子DNA损伤程度。但显微镜与流式细胞仪相比，可能会低估精子DNA损伤程度，这是由于显微镜对于微细的DNA损伤敏感度较低所致[17]。TUNEL采用流式细胞仪分析时精确度更高，变异率低于3.4%[18]。
彗星实验(comet assay)，又称为单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，是一种公认的细胞毒性试验，目前已被广泛用于细胞DNA链断裂的检测[19]。其原理是将精子悬液与琼脂糖混合均匀平铺在玻片上，凝固后精子DNA溶解并解链，再进行电泳。精子DNA损伤时DNA超螺旋结构变松散，负电荷暴露，电泳时损伤的精子DNA向阳极移动，形成"彗星"的尾部，而未损伤的精子DNA会向阴极移动形成"彗星"头部，然后用DNA荧光染料处理后在荧光显微镜下观察。通过检测彗星的荧光强度、头尾长度，再依据相应的参数来评估精子细胞DNA损伤程度。彗星实验有多种方案，如中性条件下可检测双链DNA断裂，碱性条件下可检测单链DNA断裂。该实验可在仅有几千个细胞的精液样本中进行检测，并且可检测到精子细胞中细小的DNA损伤，被认为是一种敏感的检测方法[20]。SCGE的重复变异率偏高，达3.7%，并且相较于TUNEL和SCSA，其检测耗时更长[18]。
精子染色质扩散实验(sperm chromatin dispersion，SCD)是由Fernández等于2003年提出[21]，之后SCD经改善制成了Halosperm试剂盒，由于保持了精子尾部的完整性，光学显微镜即可观察结果，是一种操作简便、费用低廉并且准确性较高的检测技术。其原理是正常精子的DNA在经过酸变性和去除核蛋白后，精子染色质结构变得松散，使得DNA环附着于残留的核结构扩散形成特征性的光晕；而DNA完整性受损的精子不产生这种特征性的光晕或光晕很小。因此，通过显微镜观察光晕的有无和大小可以判断精子DNA的完整性。Zhang等[22]研究结果表明，SCSA、TUNEL和SCD对于精子DNA碎片的检测同样有效，但是SCD似乎比TUNEL更加敏感。
DNA流式细胞技术(flow cytometry，FCM)又称为DNA荧光激活细胞分类术(fluorescence activated cell sorting，FACS)，其原理是可利用碘化丙啶(propidium iodide，PI)作为DNA标记的荧光色素，即一种膜不透性的DNA探针，但是只能进入质膜破损的精子并嵌入双链核酸中的碱基对上，通过FCM结合荧光染料可以间接反映染色质缩合度，从而推测染色质的成熟度来判断生育力。随着精子的病理程度增加，核染色质缩合度降低，PI与DNA结合量增加，荧光均值增加。杨泽星和唐向辉[23]研究结果显示，在精液常规检测结果显示正常的精液中，亦有少数精液在DNA FCM检测中可见异常变化，这表明DNA FCM能发现精液常规检测中不能发现的信息，精子DNA损伤可能是引起该类患者不育的原因。FCM不仅具有灵敏度高的优点，还能客观、快速地通过对精子DNA质量的分析来揭示精子发生及成熟过程中的病理变化。
除了上述检测方法外，尚有PCR、荧光原位杂交技术、基因芯片技术及拉曼光谱仪等检测方法。但是关于这些检测技术目前尚缺乏标准化、规范化的操作方法及严格的质量控制来保证精子DNA损伤检测的准确性。
精子DNA损伤与男性不育有密切关系，不育男性的精子DNA碎片化程度显著高于正常男性[24]，尤其在特发性不育中，约20%患者有高水平的精子DNA损伤，可影响受精、受精卵着床、胚胎植入及存活等多个环节[25]。目前评估精子DNA损伤较常用的指标是精子DNA碎片指数(DNA fragmentation index，DFI)，但是关于精子DNA损伤的阈值与男性不育的关系，目前尚无统一标准。Bronet等[26]研究结果显示，当DFI>27%时，女性受孕率及妊娠率明显下降。如将DFI值控制在27%以下甚至更低时，将大大提高男性的生育力。另外，有学者认为有生育力男性的DNA双链损伤程度明显低于不育男性，并且多为单链DNA损伤，可能是由于单链DNA损伤可通过自身修复而不会对生育造成太大影响，但是双链DNA损伤的精子无法自身修复，因此双链DNA损伤可能是引起男性不育的真正原因。关于精子单、双链损伤的研究正在逐步开展，多数学者认为其参考价值优于DFI[27]。
宫腔内人工授精(intrauterine insemination，IUI)作为传统的辅助生殖技术，是治疗男性不育症的重要方法之一，临床妊娠率可达15%～20%。男性不育症多与精子质量不良密切相关，精子DNA完整性检测能更有效地评估精子质量和预测男性生育力。Bungum等[28]研究结果显示，精子DFI>30%是受孕率明显下降的阈值，当DFI>30%时，自然受孕和IUI成功率几乎为零。刘红海[29]研究结果表明，精子DNA完整性越高，精液质量越高，精子总数及前向运动精子率越高，临床妊娠率越高，从而说明精子DNA损伤可能是通过精子质量影响IUI成功率。
目前，关于精子DNA完整性的流行病学资料显示，精子DFI程度与体外受精(in vitro fertilization，IVF)成功率成负相关关系。但是关于高DFI患者行卵母细胞胞质内单精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)还是传统的IVF，尚存在争议。Anifandis等[30]研究结果显示，高DFI组行IVF患者与高DFI组行ICSI患者的妊娠结局比较，差异无统计学意义(P>0.05)。但是另有文献报道，高DFI组患者接受ICSI比接受IVF者的临床结局更有利，其中，受精率[25,26]、临床妊娠率[22,31,32,33]及分娩率更高[22]。Chi等[34]研究结果也表明，在低DFI组(DFI≤30%)行IVF或ICSI周期患者的妊娠率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但是在高DFI组(DFI>30%)中，ICSI周期的妊娠率高于IVF周期，并且差异有统计学意义(P<0.05)，此外，高DFI组和低DFI组流产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。因此认为，对于精子高DFI组行ICSI比IVF更能改善不育患者的妊娠结局，这可能是由于ICSI周期多选择形态正常并且运动快的精子有关。Chi等[34]研究结果还表明，ICSI周期中高DFI者和低DFI者的DFI比较，差异有统计学意义(P<0.05)，但二者妊娠率比较，差异却无统计学意义(P>0.05)，这表明ICSI可以减少因DNA损伤引起的妊娠率降低。
人类精子DNA的完整性对于父系基因稳定遗传给后代有重要作用。随着辅助生殖技术的发展，尤其是ICSI技术的应用，携带DNA损伤的精子可越过卵子透明带和宫颈黏液的筛选，直接注入卵子并受精。受精卵及卵母细胞对受损的精子DNA有一定修复能力，但是一旦超过其修复能力，有遗传缺陷的DNA就传递给下一代，引起遗传性疾病发生。精子DNA损伤是诱变剂，若受精卵在第1次卵裂前对其修复失败就会引起突变，并且同一种系突变位点固定，该突变可能与男性不育、儿童期肿瘤及基因印记缺陷相关疾病，如Angelma，Beckwith-Wiedeman综合征有关[35]。Fernández-Gonzalez等[36]研究结果证实，与IVF相比，精子DNA损伤的小鼠行ICSI后，后代发生肿瘤的数量显著增加。但是，Kumar等[37]研究结果发现，精子DNA损伤小鼠行ICSI后产生的后代除了体细胞和生殖细胞存在高水平的基因组不稳定外，并未发现存活1年内的小鼠具有肿瘤易感性。并且其研究结果还发现，接受高剂量射线处理(10.0 Gy)的小鼠，其后代出生后10周内，死亡率为37%，明显高于未经射线处理的小鼠，表明小鼠死亡率与父系精子DNA的累计损伤量有关，但是小鼠出生后10周至一年，无一例小鼠发生死亡[38,39,40]。究其原因，可能与小鼠出生后10周为小鼠的快速发育时期，早期胚胎发育过程中对DNA损伤反应是阶段性的，因此推测，胎儿的异常损伤反应途径或基因组的不稳定性最终导致了后代早期产后死亡[30]。人类是否存在该作用机制，尚需进一步实验证实。此外，精子DNA损伤引起后代早期死亡的机制也需进一步明确。
综上所述，精子DNA损伤的检测对评价男性不育及生殖结局具有重要的临床意义。关于如何降低精子DNA损伤对辅助生殖技术结局及后代的影响是目前迫切亟待解决的问题。
