选择植入发育潜能更高的胚胎是辅助生殖技术(ART)中最主要的挑战之一。形态学评分法是目前运用最为广泛的胚胎质量评估方法，但是由于存在观察者的人为误差，导致该方法评价胚胎质量并不准确。近十年，代谢组学和蛋白质组学不断发展，结合傅立叶变换红外(FTIR)光谱、近红外光谱(NIR)、1H-质子核磁共振(1H-NMR)光谱、拉曼光谱技术等新技术的临床应用，可以精确检测胚胎培养液中的各种代谢产物，如丙酮酸、氨基酸、人类白细胞抗原(HLA)-G等。研究结果表明，妊娠组胚胎培养液代谢产物与未妊娠组不同。因此，无创性代谢组学及蛋白质组学对于胚胎质量的评估，或许可被运用于临床指导体外受精(IVF)方案的调整，选择最优质的移植胚胎。然而，形态学评分法、代谢组学和蛋白质组学均不能检测胚胎染色体异常，基因组学可弥补这一缺憾。通过胚胎移植前基因组检测和筛查，可以排除非整倍体性胚胎，从而提高ART助孕成功率。笔者拟就胚胎质量评估方法研究的最新进展进行阐述。
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辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)为不孕不育症患者带来了希望。在过去40年，尽管体外受精(in vitro fertilization，IVF)技术取得长足发展，但是其助孕成功率仅为40%～50%[1]。为提高IVF成功率，多数生殖医学中心进行多胚胎移植，而使多胎妊娠率随之增加，导致的新生儿早产、死产、低出生体重、出生缺陷及母亲妊娠期高血压疾病等并发症发生率，均较自然妊娠显著增高[1]。因此，评估卵子及胚胎发育潜能，选择最优质的单个胚胎进行移植，对于改善IVF妊娠结局、孕育健康子代具有极其重大意义。笔者拟就胚胎质量评估方法的最新研究进展进行阐述。
对胚胎进行形态学评估，是现今最常用的胚胎质量评估方法，特别是随着胚胎培养延时摄像系统(time-lapse system，TLS)的临床应用，为胚胎发育的观测提供了新方式。胚胎TLS采取设定时间间隔，实时获取胚胎的数字图像。TLS可以安装于现有胚胎孵化器，或者直接作为联合延时孵化系统，观测胚胎发育[2]。TLS的优点主要包括：①临床可通过大量详细的延时摄像图，更好地评估和挑选优质胚胎，使对胚胎质量的传统形态学评估，发展为形态动力学评估。②改进胚胎培养条件，降低人为因素的影响，胚胎不再暴露于台式光学显微镜，其所处的温度和空气成分组成保持稳定。TLS这一动态评估胚胎发育过程，主要评估胚胎发育的原核(pronuclear)期、卵裂期、囊胚期3个时期。
正常情况下，对卵母细胞受精情况的评价，在卵母细胞胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)后14～16 h，常规IVF后16～18 h，合子处于原核期时进行。基于原核的数目及形态，核仁、核前体的数量、大小和分布，以及受精卵细胞质晕(halo)情况，有学者提出Z评分系统[3]。双原核双极体出现，被认为是正常受精。核前体在卵母细胞发育中具有重要作用，可能与基因印迹相关，理想的核前体形态为每个原核内存在5～7个核前体，核前体数目不一致或者核前体分布不均都被认为异常。受精卵细胞质晕的形成，代表细胞质器官，尤其是线粒体向合子中央流动，可用于胚胎发育潜能评价、妊娠结局预测。当2个原核相互靠近，而且位于卵子中央；核仁大小一致，而且在靠近原核连接线处呈线形排列；原核周围有清晰的受精卵细胞质晕；在受精后24～25 h受精卵发生第1次分裂(2-细胞)时，按照Z评分系统评分为Z1，判断为优质受精卵。Z评分系统可预测囊胚形成，但是由于胚胎发育是一个动态过程，原核形态仅代表受精卵状态，因此原核评分与胚胎植入率关系不大。
受精后25 h达到2-细胞期的胚胎，称为"早期卵裂胚胎"，移植这一时期的胚胎，可获得更高的临床妊娠率。受精卵第1次分裂时间对于评估胚胎质量及其生存潜力至关重要，因为受精后25～29 h卵裂与胚胎发育潜能密切相关，所以早期卵裂被认为是胚胎发育的重要预测指标[4]。Hesters等[5]研究结果显示，受精卵的第1次分裂得到的2个卵裂球的大小与胚胎结局有关，若卵裂球大小一致，则预示胚胎质量更高。Watanabe等[6]采用TLS对胚胎进行观察的结果显示，36.7%胚胎在第1次卵裂时可形成异常3-细胞(受精后发生第2次分裂)，导致囊胚形成率低，因此受精后第2天的3-细胞胚胎应该被舍弃。Desch等[7]研究结果表明，经ICSI获得的胚胎中，若受精后的2-细胞期出现多核现象，则该胚胎的植入率和活产率将大大降低，这可能与染色体多倍性有关。上述结果均佐证了早期卵裂对妊娠结局的重要影响。
根据受精后第2、3天的卵裂率、卵裂球大小、细胞质碎片及空泡等细胞质形态，可大致评估胚胎质量与发育潜能。目前认为，发育速率过快或过慢的胚胎，妊娠结局均不佳。受精后第1天应达到2-细胞期，第2天应达到4～6-细胞期，第3天应达到7～9-细胞期。若卵裂球大小不均，则意味着其非整倍体等遗传缺陷可能性大，导致的多核几率高，可严重影响胚胎种植潜能[8]。细胞质碎片是严重缺陷的卵裂球退化形成的细胞质结构，该碎片本身对胚胎发育无影响，但是细胞质碎片过多往往伴随着细胞大小不均和正常卵裂球减少，这与低囊胚形成率、植入率、妊娠率有关。细胞质空泡常预示胚胎发育受损。因此，卵裂期胚胎移植时常选择发育速率适中、卵裂球大小基本均匀、细胞质碎片少、细胞质均质的胚胎进行移植。Mizobe等[4]采取TLS观测卵裂方向和精准时间的结果发现，第1次卵裂在受精后25.90 h、第2次卵裂在受精后37.88 h的胚胎，更易培养至囊胚阶段，而且移植这些囊胚可获得更高的妊娠率。无论细胞质是否有碎片，第1次卵裂为2-细胞、第2次卵裂为4-细胞的胚胎，往往有较好的囊胚形成率和妊娠结局[9]。TLS获取的胚胎形态动力学参数，亦可能是评估胚胎质量的较好指标。
一项回顾性研究分析2-细胞和4-细胞期多核现象对于胚胎植入率影响的结果发现，2-细胞期多核现象很常见(42.53%)，其对胚胎植入率无影响[10]，这与Desch等[7]研究结果不同；而4-细胞期多核现象(14.47%)较2-细胞期低，可降低胚胎植入率[10]。究其原因，Aguilar等[10]认为，2-细胞期多核现象多为可逆(73.4%)，而4-细胞期多核现象，则难以恢复正常。
随着序贯培养基系统的不断改进和低氧培养环境的使用，可以将胚胎培养至第5～6天的囊胚期后，再进行囊胚移植。选择性单囊胚移植(elective single blastocyst transfer，eSBT)，可有效降低多胎妊娠率[11]。临床工作者除了思考如何将胚胎顺利培养至囊胚期外，还面临着如何选择最优质囊胚的挑战。目前临床上最常用的囊胚质量评估方法为囊胚分级系统。该囊胚分级系统根据囊胚发育阶段、内细胞团和滋养层细胞的综合情况，对囊胚质量进行评定。首先，根据囊胚腔是否扩张，将囊胚分为6级：1级，早期囊胚，囊胚腔体积<1/2胚胎体积；2级，囊胚，囊胚腔体积>1/2胚胎体积；3级，完全囊胚，囊胚腔充满整个胚胎；4级，扩张期囊胚，囊胚腔扩张，囊胚直径>最初胚胎直径，透明带变薄；5级，正孵出的囊胚，滋养层正从透明带中孵出；6级，已孵出的囊胚，囊胚完全从透明带中孵出。然后，对处于3～6级囊胚，依据内细胞团和滋养层细胞所占比例及排列紧密程度，可将其分为A、B及C级。Milewski等[12]采用TLS建立预测囊胚移植后妊娠结局的动力学参数回归模型的结果显示，植入组与未植入组囊胚的动力学参数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。采用TLS建立的动力学参数回归模型表明，测定囊胚移植后妊娠结局的动力学参数，对选择优质囊胚具有重要价值。
虽然TLS已普遍应用于对胚胎发育的实时观测，但是Basile等[13]认为，TLS预先设定的每5 min拍摄1张图片，使胚胎过于频繁暴露于光线中，虽然总紫外线辐射量很少，但是仍然可能对胚胎造成潜在伤害。另外，配备TLS的胚胎培养箱的价格，明显高于传统的胚胎培养箱，增加患者的经济负担。Racowsky等[14]也认为，根据目前的数据、调查结果而言，并无证据表明配备TLS的胚胎培养箱，可以取代传统的胚胎培养箱。目前TLS尚处于试验阶段，对于TLS应用于胚胎发育观测的临床应用价值，尚需大样本、多中心、随机对照试验进一步研究、证实。
近十年来，分子生物学检测技术的发展和人类基因组的解密，使得采用代谢组学(metabolomics)方法检测卵子及胚胎质量逐渐成为研究热点。代谢组学研究对象是溶液、组织、细胞等生物样本中相对分子质量≤1 000的小分子代谢物，由此定性和定量分析胚胎生长发育过程中代谢水平的整体变化。就目前研究结果而言，使用光谱学和非光谱学检测卵泡液或者胚胎培养液中代谢物，可结合形态学推测卵子或胚胎发育潜能，常用的检测项目包括丙酮酸、葡萄糖、氨基酸、活性氧含量，以及胚胎氧消耗量(oxygen consumption，OC)等。
目前，临床可采取的光谱学检测法，包括傅立叶变换红外(Fourier transformation infrared，FTIR)光谱，近红外光谱(near infrared spectroscopy，NIR)，1H-质子核磁共振(1H- proton nuclear magnetic resonance，1H-NMR)光谱，以及拉曼光谱技术等，对卵泡液或者胚胎培养液中代谢物进行检测，从而评估IVF胚胎质量。NIR技术依靠样品(泡液或者胚胎培养液)中分子功能团吸收射线后，增加的振动能量和振动频率特征，对代谢物进行定量分析，其优点是对于小体积(<15 μL)样品，也可直接进行检测，无需分离或样品制备。然而，一项荟萃分析研究结果显示，采取NIR联合胚胎形态学评估法选择胚胎的活产率，与单独采取胚胎形态学评估法选择胚胎的活产率比较，差异无统计学意义(P>0.05)[15]。1H-NMR光谱技术以其对含氢代谢产物的普适性，而可应用于多数代谢物检测，优势在于能够对样品实现无创性、无偏向检测，具有良好客观性，样品处理简单。虽然由于1H-NMR光谱技术存在价格昂贵、机器设备大型、产量低及特殊专业要求的劣势，使得该技术尚未常规应用于临床，但是1H-NMR光谱技术对于评估IVF胚胎质量的研究，具有非常重要的临床意义。然而，也有研究认为，基于1H-NMR光谱技术的代谢组学评估，并不能提高胚胎选择效率，因此不能提高IVF成功率[16]。拉曼光谱仪通过检测样品中分子功能基团吸收电磁射线强度和波长位置的变化，从而可对多种样品进行快速、无创、定量分析。Parlatan等[17]采用拉曼光谱仪对胚胎培养液中氨基酸进行检测的结果表明，该技术评估胚胎潜能较胚胎形态学评分准确度更高。
非光谱学评估IVF胚胎质量的方法，主要包括质谱学、色谱学、色谱-质谱联用技术等。色谱-质谱联用技术结合色谱和质谱优点，可同时定量测定几百个化学结构和性质不同的化合物，包括有机酸、大多数氨基酸、糖和脂肪酸，其分辨率和检测灵敏度均较高。色谱-质谱联用技术主要包括气相色谱(gas chromatography，GC)，高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)技术等。胚胎受精后第1～3天培养液中氨基酸浓度的变化与胚胎种植潜能有关，这提示检测胚胎培养液中氨基酸的代谢，可预测胚胎发育潜能[18]。Yang等[19]采用HPLC技术对胚胎的关键代谢产物进行无创分析的结果发现，植入组和未植入组胚胎的关键代谢产物比较，差异有统计学意义(P<0.05)。胚胎OC值可反映线粒体代谢功能，因此可用于推测胚胎质量。Tejera等[20]通过电化学氧传感器结合TLS测定胚胎发育各时段的OC值，其观察到OC值在胚胎分裂期显著增高，而且第1次分裂时较高的OC值与良好妊娠结局相关。
代谢组学评估IVF胚胎质量，因其非侵入性的优点而受到临床广泛关注，与其相关的各项新技术的研究进展令人惊喜。但是，对于代谢组学对胚胎质量评估的作用，迄今尚存在争议，同时由于该技术成本昂贵、耗时长、需要专门设备和技术人员等，限制其在临床的应用、推广。
蛋白质组学(proteomics)是指应用各种技术及手段研究蛋白质组的一门新兴学科，其研究发育中的胚胎产生和分泌的蛋白质，以反映胚胎发育状态，揭示蛋白质功能与细胞生命活动的规律。目前通过质谱法，酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及其他电离方法等，可精确、快速、简便地定量测定微量样品产生和分泌的蛋白质含量。采取蛋白质组学对胚胎培养液中的蛋白质进行分析，如人白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-G，血小板活性因子，瘦素，泛素等对于妊娠结局的影响[21]。其中，对于胚胎培养液中HLA-G的研究最多。
胚胎培养液中的HLA-G是非经典的HLA-Ⅰ类分子，特异性高表达于人类早期胎盘的绒毛外细胞滋养层，在胚胎植入过程中的母胎界面免疫耐受方面发挥着重要作用，被认为是重塑母体免疫应答最重要的因素之一[22]。2017年的一项荟萃分析研究结果表明，胚胎培养液中游离型HLA-G的存在，有利于获得较高的胚胎着床率和妊娠率[23]。但是，HLA-G对于预测胚胎植入性方面的作用，迄今尚存争议，主要原因在于不同ELISA方法测定HLA-G浓度的结果变异较大。McReynolds等[24]在囊胚分泌物中发现，脂质运载蛋白-1在非整倍体囊胚分泌物中高表达，因此认为该蛋白质与胚胎非整倍体相关。Dominguez等[25]通过分析囊胚培养液中蛋白质成分的结构发现，白细胞介素(interleukin，IL)-6是预测胚胎植入率的较好指标。采取IL-6预测指标结合TLS形态动力学参数的研究结果显示，胚胎分泌物蛋白质组学分析结合胚胎形态动力学评估，可预测胚胎植入率。Dominguez等[25]首次报道采用上述2种技术结合的方法，评估人类胚胎植入率。
然而，迄今关于胚胎培养液蛋白质组学的知识尚有限，并且蛋白质组学研究技术有限，而使临床对蛋白质组学的开发和应用受到阻碍。另外，胚胎培养试剂制备的相关问题，特别是许多研究中心在胚胎培养基中使用含白蛋白血清作为蛋白质来源[26]，阻碍了胚胎培养液蛋白质组学研究。
基因组学(genomics)是以分子生物学、电子计算机和信息网络技术为手段，研究基因组结构、结构与功能关系，以及基因之间相互作用的一门学科。染色体异常对胚胎或者胎儿常具有致死效应，年龄>40岁妇女的卵子非整倍体发生率>50%[27]。因此，就理论而言，染色体异常筛查可提高单基因遗传性疾病和染色体异常患者的检出率，降低自然流产率。目前，染色体异常筛查常用方法，主要包括胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)，植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening，PGS)。
PGD通过在配子或者早期胚胎阶段对胚胎遗传性疾病进行分子遗传学诊断，获得无疾病表型胚胎进行移植，从而避免遗传性疾病新生儿出生，给新生儿家庭带来生理和精神创伤。PGS主要针对高龄、复发性流产和IVF胚胎种植失败的夫妇开展，目的是筛查胚胎非整倍性改变。PGD/PGS采集的活组织检查样品通常为6～8-细胞期卵裂球、囊胚球和极体，其中最常用的是囊胚球，因为对其进行活组织检查的准确率更高，对胚胎伤害更小的缘故[28]。目前，关于囊胚液的取样和检测囊胚液中游离核酸的研究逐渐增多，研究者认为采取囊胚液中来源于内细胞团或滋养层细胞的游离DNA进行活组织检查，既保证了对胚胎基因学研究的准确率，又确保了对胚胎的无创性检测[29]。但是，在实际应用中，仅约80%囊胚液含有可供分析DNA，因此该方法尚不能普遍适用于临床[30]。另外，通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription- polymerase chain reaction，RT-PCR)将致病基因表达的mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行扩增，可进一步检测目的基因有无异常。该项基因诊断技术，目前已成功应用于临床对马方综合征患者的PGD中。随着PGD/PGS技术的推广，越来越多的实验研究结果证实，其可降低遗传性疾病儿的出生风险，从而降低选择性终止妊娠发生率[31]。对胚胎质量的基因组学研究，从仅可检查个别染色体的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)技术，到可反映全基因组的比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)技术；从可扩增单细胞整个基因组的全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)技术，到分辨率及杂交灵敏度均极高的微阵列技术，极大扩展了PGD/PGS的应用范围，使我们有理由相信，PGD/PGS技术对胚胎质量的基因组学研究方面，在不久的将来一定能发展至新的、更高的水平[32,33,34]。
对于IVF人群是否常规采用遗传学检测方法进行胚胎质量评估，生殖医学领域迄今尚存在争议。PGD/PGS过程中，有创性的胚胎活组织检查，是否影响胚胎发育潜能及增加胎儿畸形率，已引起人们重视。迄今尚无具有说服力的随机对照试验结果表明PGS可提高IVF活产率[35]。上述针对胚胎质量评估的检测方法，均或多或少存在缺陷。FISH是一种应用非放射性荧光物质，采用核酸探针杂交原理检测细胞核中或染色体上是否存在DNA及DNA含量的方法。但是，由于FISH存在荧光信号衰退、重叠及扩散等缺点，可造成检测结果的假阳性或假阴性，而且受荧光染料颜色的限制，一次仅能对有限的几条染色体进行胚胎植入前诊断。PCR技术对胚胎质量的评估，不适合用于检测染色体结构畸变或者单亲二体染色体[28]。
综上所述，IVF胚胎质量评估方法，迄今尚无完善的标准，胚胎的形态学评估方法，仍然是目前临床进行胚胎质量评估的最主要方法。随着科技的进步，各种新技术、新方法不断应用于该领域，但是每项技术各有其优、缺点，仅单凭一种方法很难达到选择最优质胚胎的目的。胚胎发育是一个连续的、不断变化的过程，只有将不同阶段的多重评估结果相结合，才有可能甄别最具有发育潜能的优质胚胎。
