蛋白质氧连-N-乙酰氨基葡萄糖(O-GlcNAc)糖基化修饰，是一种重要的蛋白质翻译后修饰(PTM)，广泛存在于细胞核和细胞质中。蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰，由O-GlcNAc转移酶(OGT)和O-GlcNAc水解酶(OGA)共同维持细胞内糖基化水平稳定，动态调节细胞信号转导途径中多种酶的功能，在许多生命活动中发挥着重要调节作用，并与多种代谢性疾病，如妊娠期糖尿病等的发生密切相关。笔者拟就蛋白质O-GlcNAc糖基化的生物合成途径、检测方法的最新研究进展进行综述。
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氧连-N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc)糖基化修饰，是指单个N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine，GlcNAc)，通过O-糖苷键与蛋白质的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基(-OH)相连接。人类早期胚胎在发育过程中，均受到蛋白质转录、翻译，以及翻译后修饰(post-translational modification，PTM)3个层面的精确调控[1]。目前研究结果显示，常见的蛋白质PTM包括相关蛋白质糖基化、磷酸化、泛素化、脂基化和甲基化等。蛋白质O-连接糖基化修饰主要包括O-GlcNAc、O-xylose、O-glucose、O-GalNAc、O-fucose和O-mannose等修饰形式[2]。
蛋白质PTM在生命机体中具有十分重要作用。PTM使蛋白质结构更复杂，功能更完善，调节更精细，作用更专一。文献报道，蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰，大量存在于人类早期胚胎的细胞质和细胞核中[3]。可能在早期胚胎发育过程中起着重要作用的蛋白质和基因，还包括NeuroD1、β-连环蛋白(β-catenin)、v-myc细胞内对应的原癌基因(c-myc)等，以及信号转导蛋白和大量转录因子等[3]。
目前通过对蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰研究发现，该糖基化修饰还参与细胞信号转导等多种生理功能的调节。在人类早期胚胎发育过程中，均伴随着复杂而精细的基因调控和蛋白质合成过程。蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰在调节基因转录、蛋白质稳定性、细胞生物进程，以及胚胎致密化、形态改变及发育等方面，均起着重要作用[4]。同时，研究结果还显示，蛋白质O-GlcNAc糖基化，还参与囊胚表面极化和致密化的发生过程[5]。
蛋白质O-连接糖基化修饰是糖链在相关转移酶的作用下，与相应蛋白质、氨基酸残基相结合的过程。1984年，蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰现象首次被发现[6]。所谓蛋白质O-GlcNAc糖基化是指在细胞质和细胞核中，大量蛋白质在酶的催化作用下，添加至蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上，或者从蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基上切除。蛋白质O-GlcNAc糖基化，是一种对细胞核和细胞质中的蛋白质功能均很重要的PTM。由于蛋白质O-GlcNAc糖基化在高等生物中广泛存在，动态的蛋白质O-GlcNAc糖基化过程，与丝氨酸与苏氨酸的磷酸化修饰存在相互作用，从而迅速成为细胞生物学领域的研究热点[7]。目前，对于蛋白质O-GlcNAc糖基化在生命活动中发挥的调节作用，仍然存在许多未解谜团[8,9,10]。Kearse与Hart[10]研究结果显示，蛋白质O-GlcNAc糖基化对于细胞有丝分裂具有促进作用。然而，迄今人们仍然未完全阐明蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM作用机制[6]。笔者拟就蛋白质O-GlcNAc糖基化的生物合成途径、检测方法的最新研究进展进行综述如下。
在细胞内只有1个蛋白质O-GlcNAc糖基化催化基因负责编码O-GlcNAc转移酶(O-linked N-acetylglucosaminyltransferase，OGT)，将底物催化，并转移至多肽链目的残基上。Wells等[11]对OGT和O-GlcNAc水解酶(O-linked N-acetylglucosaminidase，OGA)进行纯化并克隆。蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM，根据Swiss-Prot数据库收录的数据显示，超过50%蛋白质O-GlcNAc，均会发生类似糖基化[12]。蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM存在多种底物修饰，同时在多种代谢性疾病进程中，如神经变性代谢紊乱、妊娠期糖尿病等，均起着非常重要的作用。蛋白质O-GlcNAc糖基化参与调节多种代谢性疾病的发生、发展过程[13]。文献报道，敲除小鼠的氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶，以及谷氨酰氨基果糖-6-磷酸酰氨基转移酶(glutamine fructose-6-phosphate amidotransferase，GFAT)后，发现尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄糖胺(uridine diphosphate-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)转移酶在蛋白质O-GlcNAc糖基化过程中起着至关重要的作用[14]。Mailleux等[15]对蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测结果显示，降低细胞内蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM水平，N-和O-聚糖的生物合成并未受到影响，不会出现OGT缺失导致的胚胎干细胞死亡。上述结果与Zhao等[16]研究结果一致。但是，氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶失活，则会导致部分成纤维细胞系细胞间隙连接缺失[15]。
氨基己糖生物合成途径(hexosamine biosynthesis pathway，HBP)是磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)中一个较小代谢途径的分支。在6-磷酸葡萄糖胺合成酶催化作用下，果糖-6-磷酸进入HBP。然后，GFAT将果糖-6-磷酸和葡萄糖胺进行转化，生成葡萄糖胺-6-磷酸和谷氨酸[16]。因此，GFAT将葡萄糖胺-6-磷酸转化成UDP-GlcNAc，该产物即为蛋白质O-GlcNAc糖基化蛋白、糖脂和蛋白聚糖的主要供体基团[17]。
蛋白质O-GlcNAc糖基化是由OGT、OGA完成糖基化蛋白PTM的添加和切除，而且只有这一组酶(OGT、OGA)发挥作用。通过对已获得基因组物种比较分析OGT基因序列的研究结果显示，OGT基因在进化过程中具有高度保守性[18]。大鼠ogt基因序列与人类OGT基因序列具有99%同源性，而人类OGT基因序列与线虫ogt基因序列具有80%同源性[18]。
在细胞质与细胞核中，OGT与其他蛋白质存在着互相调节的关系，允许营养物质在不同的细胞器和细胞区室之间进行有条件传送[19]。根据OGT在细胞内的定位，可将其分为：细胞核与细胞质OGT(nuclear/cytoplasmic OGT，ncOGT)，线粒体OGT(mitochondrial OGT，mOGT)，短小OGT(short OGT，sOGT)。其中，ncOGT是OGT的最长亚型。mOGT主要存在于线粒体内，其N端具有线粒体靶向序列和一个跨膜α螺旋，在细胞内具有多种作用，如机体对压力的耐受，就是由mOGT作用完成的[20]。sOGT则是OGT的最短亚型，在细胞中广泛分布，其作用为抑制细胞凋亡。这3种OGT亚型，均具有相同的OGT催化结构域[21]。
OGA是与OGT相对应的另外一种可溶性糖苷酶，负责切除蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM。多数有活性的OGA定位于细胞质内，少量有活性的OGA定位于细胞核[22]。OGA是一种在哺乳动物各种组织中广泛表达的酶，在大脑组织中含量最高。OGA主要包括2种亚型，较长的亚型主要位于细胞核与细胞质内，较短的亚型则分布较广，但是均具有OGA活性，均参与蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM调节。对于OGA基因序列的对比研究发现，人类OGA与小鼠oga基因序列具有55%同源性[23]。在OGA纯化过程中，OGA可与蛋白质形成复合体。因此推测，OGA与OGT一样，受其他蛋白质相互作用的调节[24]。
迄今对于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM尚缺乏快速、准确和特异性、稳定性均高的检测系统[25]。蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM传统检测方法，是利用放射性核素标记尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)-3H gal。科学家们利用放射性核素标记的UDP-3H底物，在体外将其与半乳糖转移酶相结合，然后进行活细胞试验，再检测UDP-3H放射性核素发现，UDP-3H gal被转移至GlcNAc第4位羟基上，再采用Edman降解，进行蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM相关检测[26]。目前，放射性核素标记法，仍然是检测蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM常用方法，其特点在于精确度高[27]。但是，该方法也存在很大缺陷，如对检测样品的量要求较大，敏感度和特异度较低等[28]。经过对该方法进行持续改进，目前该方法对于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测特异度，已经有所提高[29]。
对于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM，采用植物凝集素法进行检测，是因为植物凝集素具有与多种糖类选择性亲合的糖蛋白[30]。多种植物凝集素可以与蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM蛋白质结合，从而可以采用植物凝集素对蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM进行富集[31]。其中，应用最广泛的检测蛋白质O-GlcNAc糖基化PTM的植物凝集素是麦胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)。WGA用于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测的优势在于，与末端含有GlcNAc和唾液酸的糖链具有高度亲和性。为了进一步提高WGA对于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测的特异度和亲和性，科学家对WGA进行琥珀酰化。琥珀酰化的麦胚凝集素(succinylated WGA，sWGA)，对末端含蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM，具有更高的亲和性[32]。但是，该方法仍然存在对于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测敏感度低的问题[33]。
随着科学技术的快速发展，对于抗原-抗体的认识不断深入。科学家纯化多种可以识别GlcNAc末端和蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰抗体，并将其应用于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测。抗体的应用，大大提高了蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测效率[34]。抗体对于蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测的优势在于，可在不纯化蛋白质的前提下，完成对相关蛋白质O-GlcNAc糖基化PTM检测，而且该检测方法具有较高特异度[35]。例如，抗O-GlcNAc抗体RL2可选择性识别蛋白质O-GlcNAc糖基化位点，而不识别O-xylose、O-glucose等修饰蛋白质。抗O-GlcNAc抗体CTD110.6，也可广泛识别蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰。抗体的应用，大大提高了蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测特异度，但是抗体法的缺点在于需要纯化多种抗体用于杂交[36]。
β-消除-马氏加成(beta-elimination followed by Michael addition with dithiothreitol，BEMAD)法对蛋白质O-GlcNAc糖基化的PTM检测的原理是，β-消除反应是放射性核素标记蛋白质O-GlcNAc修饰的方法，此方法主要是利用人工改造的糖基转移酶[37]，在碱性条件下，蛋白质O-GlcNAc修饰的苏氨酸和丝氨酸，则可发生β-消除反应，侧链的碳原子和α碳原子之间形成双键，加入二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)后，可以解开双键，其后与硫醇反应，形成二硫键，然后经过硫醇亲和柱，即可选择性富集O-GlcNAc修饰的蛋白质。BEMAD法是利用DTT的解双键作用，选择性富集O-GlcNAc修饰的蛋白质，使其分子质量增加，即可准确鉴定O-GlcNAc修饰位点。同时，还可以利用不同标志物标记DTT，进行不同蛋白质O-GlcNAc糖基化PTM的相对定量检测。BEMAD法在质谱分析时，由于DTT的修饰而相对稳定，避免了未修饰的糖苷键在质谱检测时易断裂而难以检测到修饰位点的缺点，DTT可抑制肽链断裂，从而提高蛋白质O-GlcNAc修饰的检测效率[38]。
对于蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的发现，揭开了蛋白质PTM的本质。在蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰被发现以后的三十多年中，科学家们的研究焦点主要集中在与蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰相关的酶和蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的发现方面。随着相关技术、方法的发展，以及新技术的开展，人们对蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰研究的深入，将会研发出更加有效的蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰检测方法，也会对蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰在细胞内的功能，有更加透彻的理解。随着蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质组学研究，蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的各种功能和调控机制也将逐渐被阐明，进一步阐明蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰在早期胚胎发育过程中的具体作用，对妊娠期糖尿病等代谢性疾病发病机制的探索，也具有重要作用，同时也有助于进一步深入了解蛋白质O-GlcNAc在机体中的作用。
