微小RNA(miRNA)是一类高度保守的内源性小分子RNA。miRNA主要通过选择性结合mRNA调控基因表达。目前研究结果表明，中枢神经系统存在大量miRNA，并参与神经细胞的正常生长、发育，以及组织损伤修复、肿瘤发生、神经退行性变等多种病理、生理过程。笔者拟就新生儿缺血缺氧性脑病(HIE) miRNA谱系的最新研究进展进行阐述，探讨其miRNA特异性表达，对新生儿HIE诊断和预后判断的意义，旨在为该病的相关诊治研究提供参考。
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传统意义上所指的遗传(heredity)，是指亲子之间及子代个体之间性状存在相似性，表明性状可以从亲代传递给子代。除了传统意义上的遗传之外，决定生物特征的因素还包括环境因素，以及环境与遗传因素的交互作用。遗传起源于早期生命过程的信息化或节律化。目前地球上已知现存的生命主要是以DNA作为遗传物质。但是，多种有机体并非基于DNA序列进行遗传，如微生物、植物、脊椎动物和无脊椎动物等[1]。对非DNA序列遗传机制的短期和长远影响进行研究，可能对完整和全面解读人体健康及其疾病遗传具有重要作用[2]。各种生物中，微小RNA(microRNA, miRNA)，是一类高度保守的内源性小分子RNA，本身不具有开放阅读框(open reading frame) [3]。不同miRNA在不同细胞和组织中表达，对植物和动物发育及相关疾病的病理、生理过程，均存在影响。miRNA异常表达与疾病状态有关[4]。成熟miRNA的5′-端为磷酸基团，3′-端为羟基，主要通过选择性结合mRNA调控蛋白表达。在细胞核内，miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ生成的较长的、具有茎-环结构的初级转录体产物初级miRNA(primary miRNA, pri-miRNA)。pri-miRNA在细胞核内被特异性核糖核酸酶类(ribonucleases, Rnase)Ⅲ核酸内切酶(Drosha酶)切割，产生约70 nt具有发夹状结构的miRNA前体(precursor miRNA, pre-miRNA)。在细胞质中，pre-miRNA经过Dicer酶加工，生成约22 nt螺旋结构成熟的双链miRNA，随后其中一条链与特定蛋白质(argonaute)形成miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-induced silencing complex, RISC)，RISC再与mRNA结合，从而抑制蛋白质翻译、表达[5]。中枢神经系统存在大量miRNA，并参与神经细胞的正常生长、发育，以及组织损伤修复、肿瘤发生、神经退行性变等多种疾病的病理、生理过程。在精神分裂症、躁郁症、重度抑郁症和焦虑症患者中，miRNA的表达均具有特异性改变[6]。
1998年，Mohr与Mott [7]对"秀丽线虫通过双链RNA造成潜在和特异的遗传干扰"研究，首次证实双链RNA分子可诱导同源目标mRNA降解，并导致特定基因表达沉默，而这种基因表达沉默，可以遗传至子代。迄今在人体中发现1 400多种miRNA。miRNA在细胞生长、凋亡、血细胞分化、神经元极性、胰岛素分泌、大脑形成、心脏发生和胚胎发生等过程中，均发挥着重要作用。
新生儿缺血缺氧性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)与miRNA表达的关系，是近年国内外新生儿领域研究的热点。伦敦玛丽女王大学儿童健康和基因组学中心学者提出，目前新生儿HIE救治成功率不足1/9，真正理解miRNA在正常神经系统发育和HIE病理、生理过程中的作用，将有助于新生儿HIE早期诊断、预后判定和靶向治疗[8]。笔者拟就新生儿HIE的miRNA谱系的最新研究进展进行阐述，旨在探讨miRNA特异性表达对新生儿HIE诊断和预后判断的意义，从而为该病的早期诊断和治疗提供新的研究思路和方法。
新生儿HIE是由于围生期窒息而导致的脑缺血、缺氧性疾病，其特征性的神经系统病理、生理性改变包括以下5个方面。①选择性神经元坏死：主要累及大脑和小脑皮质神经元；②基底节丘脑损伤：主要累及基底神经节和丘脑；③大脑矢状旁区损伤：常见于足月儿，多累及大脑额中回，经旁中央区至枕后部位；④脑梗死；⑤脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia)[9]。
新生儿HIE是导致患儿脑性瘫痪、智力低和早期死亡等重要病因，亦是造成医患矛盾及家庭、社会负担与严重危害儿童健康的主要原因[10]。HIE最重要的病理、生理机制，是缺血、缺氧影响神经细胞生长、发育[11]。由于miRNA参与神经细胞正常生长、发育，因此将miRNA作为新的潜在分子生物标志物(biomarker)和可能的治疗靶点，将对新生儿HIE早期诊断、预后判断和治疗，均具有极其重要意义[4]。
miRNA-210被认为是导致患儿缺血缺氧反应的特征性miRNA，miRNA-210具有细胞和组织特异性，在体内不同部位损伤时，miRNA-210表达水平各异[12]，其生物学功能也有所不同。文献报道，大鼠妊娠期缺氧可导致miRNA-210表达增高，从而使新生大鼠糖皮质激素受体表达下降，减少神经元细胞死亡，缺氧与miRNA-210表达存在剂量依赖关系，因此miRNA-210具有神经元保护作用[13]。Qiu等[14]研究发现，利用氧、糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)机制建立HIE动物和细胞株体外培养模型，经逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测结果显示，在OGD 4 h后，嗜铬细胞瘤PC12细胞株的miRNA-210表达上调，并且可预防细胞凋亡。Western蛋白质印迹法检测发现，敲除miRNA-210后，细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspases)-3、-9和bax蛋白下降，而bcl-2蛋白表达增加。研究认为，miRNA-210通过抑制Caspases活性、调节bcl-2和bax蛋白水平，减少神经细胞凋亡，从而发挥神经保护作用。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1α，是缺氧损伤时影响大脑发育的一个重要因素。Rdom-Azik等[15]研究发现，缺氧细胞和组织中的HIF-1α可激活miRNA-210表达。miRNA-210的直接作用靶点是肝配蛋白(ephrin，EFN)A3。正常细胞中虽然也表达miRNA-210，但是细胞缺氧时，miRNA-210表达显著增高。Cicchillittic等[16]对HIE大鼠病理模型的研究结果显示，miRNA-210主要在大鼠大脑和大脑中动脉血管闭塞区域表达。Wang等[17]采用尼古丁建立新生大鼠HIE模型的研究发现，新生大鼠接触尼古丁，可显著增加其脑梗死体积。同时，miRNA-210表达水平增高，脑神经营养因子/原肌球蛋白相关激酶异构体B(brain-derived neurotrophic factor/ tropomyosin-related kinase isoform B，BDNF/TrkB)表达降低，可导致新生大鼠大脑HIE后遗症的发生。向新生大鼠侧脑室注射miRNA-210抑制物，即miRNA-210互补锁定核酸(miRNA-210-complementary locked nucleic acid，miRNA-210-LNA)，可显著缩小新生大鼠缺血、缺氧诱导的脑梗死区域体积，提高尼古丁介导的新生大鼠大脑BDNF/TrkB蛋白质表达，则可逆转尼古丁介导的HIE。
由此可见，miRNA-210参与新生儿HIE的病理、生理过程，从不同层面调节细胞存活、血管内皮细胞迁移、分化及毛细血管网形成。但是，各项研究结果不尽相同，因此miRNA-210表达与新生儿神经细胞生长、发育及HIE预后的关系，尚待进一步深入研究和证实。
经微阵列和RT-PCR检测的结果显示，在缺血、缺氧条件下，氧化应激可导致血管损伤，血管内皮细胞中，可高表达miRNA-126，因此miRNA-126被认为是内皮细胞特异性的miRNA[18]。2008年，van Solingen等[19]对小鼠HIE动物模型研究首次证实，在缺血状态下，miRNA-126具有促进血管新生的作用。miRNA-126表达与HIE动物模型的脑缺血再灌注损伤程度呈正相关关系，它可通过增加血管内皮细胞生长因子mRNA或其受体的表达，从而促进血管新生[20]。彭彬等[21]研究结果表明，成年人急性脑梗死早期，外周血中miRNA-126水平与脑侧支循环建立呈正相关关系。另外，其研究结果还显示，脑侧支循环建立良好组患儿的外周血中，miRNA-126表达水平显著高于脑侧支循环建立不良组。这提示，miRNA-126具有促进血管新生的作用。Li等[22]研究结果表明，新生儿在持续缺血3 h后，miRNA-126表达水平显著下降，而外周血miRNA-126表达水平变化，可以区分和鉴别诊断脑组织重度持续性缺血和轻度短暂性缺血及其损伤程度。
由此可见，miRNA-126无论是对新生儿与成年人HIE，以及对小鼠HIE动物模型血管内皮细胞的修复、侧支循环的建立及血管新生等，均具有重要作用。但是，目前尚缺乏miRNA-126在新生儿HIE疾病诊断和预后判断价值的相关研究[23]。
在成年人和胎儿大脑中，高度保守的miRNA-124含量最为丰富，并且脑出血患者血清miRNA-124水平显著高于脑缺血患者。由此推测，miRNA-124可用于鉴别诊断引起脑缺血和脑出血疾病的不同病理、生理改变[24]。在活化小胶质细胞中，miRNA-124表达下调[25]。Jeyaseelam等[26]采用微阵列方法，分别对成年大鼠短暂性缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)病理模型建模24 h和48 h后，其大脑中动脉血管闭塞区域血液和脑组织中miRNA-124水平进行分析的结果显示，外周血可高度表达miRNA-124a，其认为，该指标可作为对实验动物脑缺血的诊断参考。文献报道，锂制剂可通过增加神经系统内miRNA-124表达，经糖原合成激酶3β独立抑制通道，从而降低控制神经元分化的抑制元素1-沉默转录因子(repressor element 1-silencing transcription factor)和蛋白去泛素化降解，达到促进脑缺血后神经元和血管再生。因此认为，锂制剂有利于脑卒中后脑神经元细胞的修复[27]。多聚嘧啶区结合蛋白质(polypyrimidine tract binding protein, PTBP)是一种选择性剪切调控蛋白。miRNA-124可通过抑制PTBP1间接使PTBP2表达水平升高，从而促使神经干细胞向神经元方向分化[28]。
由此可见，miRNA-124表达与中枢神经系统缺血、缺氧性病变有着密切关系。同时，其对神经系统受损后的神经元细胞生长及恢复脑组织血供，具有重要意义。
miRNA-200家族成员包括miRNA-200a、-200b、-200c、-141及-429。增加miRNA-200家族成员的表达水平，可促使神经元细胞分化；而降低miRNA-200家族表达，则可促使神经元细胞增殖，其作用机制为miRNA-200家族通过调节重编程转录因子SOX2和KLF4发挥作用[29]。骆健明等[30]对新生大鼠HIE病理模型进行minRNA-200a水平测定的结果显示，其脑海马区miRNA-200a表达水平显著升高，神经干细胞数目增多，这提示缺血、缺氧后，miRNA-200a表达水平升高与神经干细胞增殖有关。叶卉初等[31]研究结果显示，miRNA-200b表达水平，与新生大鼠HIE病理模型髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)表达有关，新生大鼠缺血、缺氧1 h后，向双侧侧脑室分别注射2 μL含miRNA-200b的纳米转染复合物，可抑制MBP表达；然而注射miRNA-200b抑制剂，则可促进MBP恢复至正常水平。这提示，miRNA-200b参与新生大鼠HIBD后神经髓鞘形成及其修复过程。
由此可见，miRNA-200家族包含多个miRNA，主要参与新生大鼠HIE病理模型的病理损伤修复。但是，对该家族不同miRNA的具体作用，仍然有待于进一步研究、证实。
通过微阵列分析新生大鼠HIE模型miRNA水平改变发现，星形胶质细胞内的miRNA-21表达增高是具有特异性的，其中血清miRNA-21水平显著升高，可能是诊断新生儿发生HIE的早期生物标志物[32]。文献报道，miRNA-21是强大的抗凋亡因子，miRNA-21过表达可减少缺血性神经元凋亡[33]。miRNA-21表达于星形胶质细胞，可调节细胞大小和神经胶质原纤维酸性蛋白质(glial fibrillary acidic protein)水平[34]。miRNA-21的靶基因是凋亡相关因子配体(factor-related apoptosis ligand, FasL)。FasL属于肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor，TNF)家族成员之一，也是重要的诱导细胞凋亡配体，miRNA-21可通过下调FasL参与神经保护[35]。机体发生HIBD后，HIF-1α mRNA可显著增高，由此推测，HIF-1α是HIBD相关的重要调控因子。研究结果显示，miRNA-21可通过上调HIF-1α表达水平，而对HIBD患者起到保护作用[36]。
由此可见，在中枢神经系统发生缺血、缺氧时，miRNA-21表达可减少神经元细胞凋亡。miRNA-21亦可能作为机体发生HIE的一个有效分子生物标志物。
非特异性炎症是导致患者发生急性中枢神经系统损伤和脑退行性病变的重要发病机制，胶质细胞在局部炎症过程中起着主要作用，脑缺血、缺氧可迅速导致非特异性炎症发生和炎性因子释放，从而导致血清中相关miRNA高表达[37]。miRNA-181a在脑组织缺血再灌注时表达上调，可加重神经细胞的炎性反应，并促进细胞凋亡。采用双荧光素酶实验对miRNA-181a的检测结果证实，miRNA-181a可直接与白细胞介素(interleukin, IL)-8 mRNA 3′-末端非翻译区(3′-untranslated region, 3′UTR)结合，并活化Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)信号通路，miRNA-181a在机体内的表达与IL-8呈负相关关系，从而导致炎症反应损伤[38]。采用脂多糖刺激机体的星形胶质细胞，可使miRNA-181c过表达，并直接导致该细胞死亡增加[39]。敲低miRNA-181家族，可促进脂多糖诱导产生的前炎症因子，如TNF-α，IL-6、-1β、-8和高迁移率族蛋白(high mobility group, HMG)B1水平增高。HMGB1是一种与组蛋白相类似的蛋白质，是一种炎症后期介质。机体过表达miRNA-181，可显著增加抗炎症因子IL-10水平[39]。Zhang等[40]研究结果证明，miRNA-181c可以直接调控TNF-α转录后产物。机体在缺氧状况时，若小胶质细胞的miRNA-181c表达下降，则TLR4表达增高，小胶质细胞的miRNA-181c直接靶点是TLR4，miRNA-181c可直接结合TLR4的3′UTR，从而降低转录因子核因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)的活性，减少促炎性介质TNF-α、IL-1β，以及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)释放。该研究还认为，miRNA-181c-TLR4信号通路，可能是治疗HIE的一个潜在治疗靶点。
miRNA-181家族的作用主要涉及HIE病理过程中的非特异性炎症调节。但是，miRNA-181a、-181b和-181c对炎症调控的作用靶点是多部位的，迄今尚未阐明，尚有待在HIE研究中进一步明确[41]。
Let-7是miRNA中最丰富的一类[42]。人let-7 miRNA家族共计13位成员，分别为Let-7a-1、-7a-2、-7a-3、-7b、-7e、-7d、-7e、-7f-1、-7f-2、-7g、t-7i及miRNA-202与-98。该家族所有成员的5′-端具有高度保守的核苷酸序列，即"TGAGGTA"，而被称为"种子序列"，这些成员分别位于9个不同染色体上。Shinohara等[43](日本理化学研习所脑科学研究中心)研究结果证明，let-7家族占大鼠双侧海马区miRNA表达总量的32%，丰富表达的let-7家族可能与大鼠海马区缺血易感性有关，let-7家族可下调细胞死亡相关因子，并加重大鼠HIBD。张旭等[44]采用miRNA芯片检测技术，对117例HIE新生儿脐带血进行分析的结果显示，HIE组与对照组新生儿脐带血中的55种miRNA水平分别比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中HIE组脐带血中let-7b-5p表达水平显著下调，其表达水平降低程度与HIE严重程度有关，但是与HIE患儿预后无关。Ponnusamy等[45]对围生期窒息新生儿的外周血、血浆和小便样本进行miRNA对比检测，以评估潜在的新生儿HIE临床生物标志物的结果显示，若采用直径为6 mm干纸片法检测到let-7b，miRNA-21、-29b、-124及-155，则可作为诊断新生儿围生期缺氧的候选生物标志物，并且let-7b表达量对新生儿围生期窒息诊断的敏感度最高。
Let-7家族是一类HIE保护性miRNA。机体发生HIE后，代偿性增高或外源性转染let-7，均可减少神经元细胞凋亡。因此，let-7既是一个诊断HIE的有效生物标志物，也有望成为HIE治疗的候选生物制剂。
miRNA-15a、-497在机体中枢神经系统缺血再灌注损伤和促进神经细胞凋亡等方面，具有重要的调节作用[46]。Yin等[47]采用OGD诱导的小鼠HIE病理模型进行的研究首次发现，当小鼠脑神经血管内皮细胞发生死亡时，过氧化酶增殖活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)Δ表达显著下降。若在HIE小鼠脑室内注射PPARΔ激动剂，可显著降低miRNA-15a表达水平，增加bcl-2蛋白质水平，降低Caspase-3活性和脑微血管中DNA断裂，减少局部脑组织短暂缺血后血脑屏障破坏和梗死。miRNA-15a可通过直接结合bcl-2 mRNA的3′UTR，从而抑制bcl-2翻译。该研究同时发现，经OGD方法处理的小鼠，发生短暂性大脑中动脉闭塞后，神经母细胞瘤N2A细胞株可表达miRNA-497；若其神经母细胞瘤N2A细胞株miRNA-497表达缺乏，则可抑制OGD诱导的N2A细胞株死亡，若给予外源性miRNA-497，则可导致OGD诱导的神经元细胞功能丧失。文献报道，miRNA-497可直接与bcl-2/-w基因3′-UTR结合，敲低脑组织的miRNA-497后，可有效促进小鼠脑缺血部位bcl-2/-w蛋白表达水平增加，缓解缺血性脑梗死的发生，从而改善神经功能预后。该项研究结果还提示，在HIBD小鼠中，miRNA-497通过bcl-2/bcl-w信号通路发挥调控作用[48]。
由此可见，miRNA-15a、-497对脑组织缺血的影响机制是一致的，即miRNA-15a、-497共同抑制bcl-2蛋白表达，诱导脑组织神经细胞凋亡，而拮抗miRNA-15a、-497的作用，则可提高脑缺血、缺氧后的神经元细胞存活。这可能是今后治疗HIE的另一个潜在治疗靶点。
miRNA-221、-222主要和脑血管生成有关，通过调节血管紧张素(angiotensin，Ang)Ⅱ诱导血管内皮迁移，并通过生成血管的关键转录因子和基因，如c-Kit、STAT5A和ZEB2间的相互作用，达到抑制血管生成的目的[49]。Ma与Zhang[48]研究结果发现，脑组织缺血后，miRNA-221、-222表达水平可显著降低，而在血管形成期，miRNA-221、-222的表达是血管内皮尖端细胞(endothelial tip cell)所必需的。若血管内皮尖端细胞不表达Fms相关酪氨酸激酶4(Fms-related tyrosine kinase 4)受体，则可导致血管生成缺陷。因此，miRNA-221、-222可能成为组织缺血后血管新生的治疗靶点。Hromadnikova等[50]对心、脑血管疾病孕妇的相关miRNA进行检测的结果发现，将合并妊娠期高血压疾病、子痫前期和胎儿宫内发育迟缓孕妇的脐带血标本与正常孕妇的脐带血标本进行对照研究的结果显示，宫内发育迟缓胎儿的大脑中动脉血液流量降低与其miRNA-221-3p表达水平下降具有显著正相关关系。因此其认为，miRNA-221-3p对预测隐匿的胎儿心、脑血管疾病具有诊断价值[50]。
miRNA-221、-222是2种高度同源的miRNA，在人类多种疾病患者中均呈过表达[51]。上述对脑组织缺血、缺氧相关研究的结果均表明，miRNA-221、-222在脑组织缺血、血氧损伤中均呈低表达。因此，对HIE采用联合miRNA-221、-222增强治疗，可能是值得研究的课题。
miRNA与新生儿神经系统发育和功能密切相关[6]。miRNA参与新生儿神经突触发育的不同阶段，包括神经突触发生，涉及miRNA-132、-134和-124，而突触形成和成熟，则涉及miRNA-134和-138[52]。研究新生儿HIE与miRNA变化的关系，有助于寻找临床早期诊断新生儿HIE的生物学指标，并对神经系统可能发生的后遗症进行预测，而分析不同种类miRNA的不同表达，则可能反映新生儿HIE的病变程度及其损害结果，随着遗传学、表观遗传学和基因表型组学等技术的发展，转染合成的miRNA拟似物(mimic)或使用反义核苷酸序列，已成为今后新生儿HIE治疗的新靶点和趋势[8]。
随着我国全面两孩政策的实施，高龄孕产妇、选择性剖宫产及孕产妇原发性疾病等，所导致的高危新生儿，包括HIE发病率的增高，使临床对新生儿HIE研究具有更重要的临床意义。降低新生儿HIE导致的神经系统疾病发生率，可提高人口质量。
所有作者均声明不存在利益冲突
