上皮性卵巢癌(EOC)就其病理学特征而言，可被分为Ⅰ、Ⅱ型EOC，二者在肿瘤来源、恶性表型方面均有所不同。Ⅰ、Ⅱ型EOC在病理学形态、临床特征、分子表型等方面，均体现出极高的异质性特点。随着二代基因测序技术对EOC分子特征数据的积累，深化了临床对EOC生物学行为的认识。综合病理及分子特征进行诊断，可能为EOC提供更加高效、精准的筛查和治疗策略。笔者拟就EOC的病理及分子诊断机制，分子诊断技术的发展现状，以及在EOC筛查和治疗应用中的最新研究进展进行阐述。
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上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, EOC)是致死率很高的妇科恶性肿瘤，占卵巢肿瘤的50%～70%，多数EOC患者被确诊时已经是晚期[1]。尽管多数EOC患者的病情在满意的肿瘤细胞减灭术后，接受以铂类药物为基础的标准化疗方案治疗，可获得初始缓解，但是大部分晚期EOC患者仍然可发生化疗耐药及复发[2]。目前，无论是基于形态学的病理诊断，还是广谱抗肿瘤化疗药物治疗，均无法应对EOC极高的异质性特点[3]。采用二代基因测序技术对EOC分子特征数据日益积累，不但有利于临床对该病患者进行更加精准分层，还可促进针对特定分子标志物研发分子靶向药物，从而使EOC患者受益[1,2,3,4,5]。笔者拟就EOC的病理诊断、分子诊断机制及其分子诊断技术发展现状，以及在EOC筛查和治疗应用中的最新研究进展进行阐述。
目前，对于EOC的认识及其分类标准，大多数是基于肉眼及显微镜下的肿瘤细胞形态学特征。十多年前，病理学家按照EOC的病理学特点，将其分为Ⅰ、Ⅱ型EOC[1]。①Ⅰ型EOC：是指直径较大、位于单侧卵巢的囊性肿瘤。Ⅰ型EOC中，除了透明细胞癌被判断为高级别EOC外，其余均为低级别、行为惰性的EOC。若Ⅰ型EOC病灶局限于卵巢，则患者预后多较好，但是晚期Ⅰ型EOC患者预后仍然较差。约10% EOC患者死于Ⅰ型EOC，并且该类患者卵巢外微小肿瘤病灶很难被发现[2]。②Ⅱ型EOC：超过75% Ⅱ型EOC患者被临床确诊时已为晚期，并且Ⅱ型EOC级别高、病情进展快。虽然Ⅱ型EOC患者肿块直径普遍较Ⅰ型EOC小，但是卵巢外病灶明显增多，并且常伴有网膜和肠系膜弥漫性受累。目前肿瘤细胞减灭术辅以化疗，对于延长Ⅱ型EOC患者无瘤生存期的效果很有限，大部分Ⅱ型EOC患者最终死于该病[3]。
2014年，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)更新了EOC的病理学分类：Ⅰ型EOC包括低级别浆液性癌(low-grade serous carcinoma, LGSC)，子宫内膜样癌，透明细胞癌，黏液性癌和恶性Brenner瘤；Ⅱ型EOC包括高级别浆液性癌(high-grade serous carcinoma, HGSC)，癌肉瘤和未分化癌。根据Ⅱ型EOC的HGSC形态学特点，可将其进一步分为常见EOC亚型与呈实性、假子宫内膜样及移行型(solid, pseudo endometrioid, transitional, SET) EOC亚型。WHO对于EOC的二元病理分型，有助于进一步研究、认识EOC的发生、发展机制。Ⅰ型EOC来源于卵巢外的良性病变，随后种植于卵巢上并发生恶性转变；Ⅱ型EOC则源自输卵管上皮内瘤变(serous tubal intraepithelial carcinoma，STIC)，随后扩散至卵巢和卵巢外，其生物学行为具有高度恶性[4]。
EOC的病理学类型多，即使在某一特定的EOC病理学类型中，EOC患者间及同一EOC患者的不同肿瘤病灶，仍然存在分子水平的异质性特点。基于二代基因测序技术的生物信息学检测数据，有利于进一步认识EOC相关分子机制，确定癌前病变来源，进而研究EOC耐药相关基因的克隆选择和演变过程等[5]。因此，在EOC二元病理分型基础上，亟需总结近年所获得的EOC分子检测数据，实现基础实验研究结果向临床精准诊疗的转化、应用[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。
区分Ⅰ、Ⅱ型EOC最重要的基于分子水平的特征为基因组稳定性。Ⅰ型EOC患者体内普遍存在DNA拷贝数变化，而Ⅱ型EOC患者的染色体具有显著不稳定性[3]。此外，病情进展更快的Ⅱ型EOC，除了具有基因组不稳定性特征外，普遍存在TP53基因突变[3,6,7,8]。事实上，癌症和肿瘤基因图谱(cancer genome atlas，TCGA)数据显示，Ⅱ型EOC中，大部分TP53基因的野生型卵巢HGSC组织，并不单纯包含高级别浆液性成分。这提示，TP53基因突变可能是Ⅱ型EOC的HGSC特异性表型[8,9]。此外，Ⅱ型EOC还常存在同源重组(homologous recombination, HR)修复，以及pRB、cyclin E1、FOXM1与Notch3信号通路异常。然而，Ⅰ型EOC常存在PIK3CA/PTEN、KRAS、BRAF、MAP、ERK和ARID1A基因的体细胞突变[3]。但是，也有二代基因测序技术的测序结果显示，非浆液性EOC中，也存在HR基因致病性突变，如BRCA1、2及CHEK2、ATM基因体细胞突变与BRCA1、2及RAD51D、CHEK2和BRIP1基因的胚系突变，尽管非浆液性EOC的BRCA1、2基因突变发生率较浆液性EOC低[10,11,12]。在Ⅱ型EOC的HGSC中，包括BRCA1、2基因突变在内的HR基因突变发生率较高[8]。
EOC患者间除了存在个体差异外，还可能存在多种分子水平的异质性及亚克隆特点，原发和复发性EOC的分子表型，也可能发生动态的纵向改变，后者可能是在接受特定治疗后，EOC在选择性压力作用下产生的反应[13,14,15]。近期一项研究对耐药性Ⅱ型EOC的HGSC进行全基因组测序的结果显示，相较于外显子测序，其不仅检测编码区，还可发现易位和重排等结构基因组异常，如基因破损和融合等[16]。该项研究结果显示，Ⅱ型EOC化疗耐药性与抑癌基因破损、失活有关，如RB1、NF1、RAD51B和PTEN基因的体细胞突变；而难治性Ⅱ型EOC，则常存在CCNE1基因扩增。此外，该项研究亦配对检测相应胚系突变的结果显示，耐药性Ⅱ型EOC中，可见BRCA1或者BRCA2基因胚系突变逆转，以及BRCA1基因启动子高甲基化缺失。8%复发性Ⅱ型EOC中，发生ABCB1基因启动子易位或融合，导致该基因编码的多重耐药蛋白质1表达失调。后续许多研究也得到相似结果，即亚克隆选择不仅发生于原发性EOC中，也发生于复发和耐药性Ⅱ型EOC的HGSC中[12,14,16,17,18]。
检测BRCA基因突变的"金标准"，包括Sanger测序和多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)技术。一代Sanger测序法可以直接检出单碱基突变，而MLPA技术可以检出一个或多个外显子缺失或重复。但是，这些技术均需要先将基因片段化，然后对各基因片段进行扩增、测序，因此十分耗时[19]。相较而言，二代基因测序技术可以高通量、平行完成大批量基因，甚至全基因组测序[20]。目前二代基因测序技术已经被用于研究EOC的基础研究和临床基因检测中，具有成本低、耗时短的优势，使得临床可在短期内获得基因检测结果，辅助临床决策，从而使EOC患者受益[21,22]。但是，不同的二代基因测序技术平台，均要求有效生物信息学分析支撑及其对庞大数据的准确解读，这是该项技术在目前临床应用中所面临的难点与挑战。
如前所述，EOC是一种在分子水平具有极高异质性的肿瘤，BRCA1、BRCA2、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、RAD51D、RAD51C、BRIP1、PALB2等多种基因的胚系突变，均与EOC的遗传易感性有关[23,24,25,26,27,28,29]。此外，EOC体内试验结果提示，与BRCA基因缺陷一样，RAD51D和PALB2基因缺陷，也可提示EOC患者对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)抑制剂和化疗药物的敏感性[24,27]。因此，对EOC患者的分子诊断，特别适合采取平行批量基因检测或外显子测序。同样，目前批量基因检测，也存在结果解释困难的问题，但是越来越多的多重基因检测结果，可以帮助临床鉴别诊断致癌性基因突变与非致癌性基因突变(仅为人群差异所致变异)。
同时，不同病理学类型EOC，其肿瘤细胞基因组存在不同突变，即体细胞突变。已经有研究者着手于探索EOC体细胞突变靶向药物，如针对BRAF、mTOR、MEK和AKT等基因突变。此外，也有研究者针对包含BRCA1、2在内的DNA损伤修复通路中的基因进行研究，探索PARP抑制剂对存在相应体细胞突变的肿瘤是否亦具有杀伤作用[8,10]。
除了于DNA水平进行测序外，转录组测序数据亦可以揭示不同时间点、不同状态下EOC分子表型，这有助于了解EOC恶性表型的动态演化过程。近十年，研究者对EOC导致相关基因变异表达活性谱测定，主要聚焦于比较EOC和正常卵巢组织的差异表达基因[30,31,32,33]。基于这些分子生物学证据，高级别EOC被进一步细分为免疫反应型、分化型、增殖型和间质型EOC[30,31,32]。Barrett等[33]系统性综述总结大量Ⅱ型EOC的HGSC患者的血液样本RNA测序结果，旨在发现EOC患者存在的相关表型的特异性异构体，即在正常卵巢组织中无表达基因，而且还发现卵巢恶性肿瘤患者中，ETV4、FOXM1、LSR、CD9、RAB11FIP4和FGFRL1基因高表达。但是，Barrett等[33]强调，由于关于EOC患者基因测序的不同原始研究之间存在选择性偏倚，该项研究结果的临床应用价值，尚有待进一步研究、验证。
大型随机对照试验结果提示，传统的CA125和(或)超声检查作为EOC的早期筛查手段，并未帮助显著延长EOC患者生存时间[34,35,36]。因此，目前迫切需要将EOC病理及分子诊断技术，应用于临床诊疗中。
目前，胚系BRCA基因突变状态检测，在EOC患者中的临床价值凸显。但是，EOC传统筛查方法对于EOC受试者的入选标准，可能漏检大量携带BRCA基因突变的EOC患者。因此，随着EOC分子诊断需求的增加及研究数据积累，英国已经调整EOC患者基因检测的纳入受试人群，并且拓宽待测基因范围和突变种类，以期使更多EOC患者受益于靶向药物，如PARP抑制剂治疗。最新研究结果表明，约15% EOC患者存在胚系BRCA基因突变，但是临床很少对该类患者进行基因检测，这是因为既往基因检测仅针对有家族史的EOC患者，并且存在检测费用昂贵、耗时长等问题[37,38,39]。Møller等[40]对所有就诊的EOC患者进行基因检测的结果显示，EOC患者BRCA基因突变携带率为23%，其中仅1/3患者存在家族史。然而，按照既往美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)和美国肿瘤外科学会(Society of Surgical Oncology，SSO)制定的指南，若仅建议针对有家族史的EOC患者进行基因检测，则可导致EOC患者漏诊率高[41]。Møller等[40]研究结果使得美国、加拿大及英国的多个中心，开始为所有非黏液性EOC患者提供BRCA基因检测。值得注意的是，欧美国家的研究数据显示，仅20%符合筛查标准的EOC患者最终接受BRCA基因检测。因此，对于EOC患者应进行胚系突变检测的整体认知，在临床实践中仍然需强化。对于EOC患者进行基因检测的益处主要在于，针对具有高危家族史的个体，可以根据基因检测结果及时采取干预措施，降低EOC发生风险。近期研究结果表明，EOC患者是否携带BRCA基因突变，可显著影响其治疗方案的制定和远期预后。因此，基因检测的价值，再次回到EOC患者自身，其结果可能对临床决策具有重要作用。所以，笔者认为，非黏液性EOC患者一经病理诊断结果确诊，均应接受BRCA基因检测。
了解导致EOC发病的分子机制的意义之一，是促进患者的精准分层及个体化治疗。目前，大部分EOC患者接受以铂类药物为基础的化疗方案治疗，但是其疗效，特别是在Ⅰ型EOC患者的治疗中并不充分。EOC的二元病理分型和分子生物学证据，可以部分解释Ⅰ型EOC患者化疗耐药性产生机制。①Ⅰ型EOC患者基因组相对稳定，不易对化疗药物产生反应；②一项基于二代基因测序技术的研究结果提示，69%复发性EOC患者至少有一个可控基因改变，其中最常见的包括TP53、MYC、BRCA1/2、KRAS和NF1基因突变[3,7,8,42]。
此外，对于染色体稳定性不佳的Ⅱ型EOC患者，其耐药机制亦可以采用一些分子实验结果解释。①抑制Ⅱ型EOC的HGSC患者PI3K/mTOR信号通路，可以诱发细胞抗凋亡信号传导，从而抑制细胞死亡，但是可使细胞对抗凋亡蛋白质抑制剂更敏感；②对包含BCL-2家族在内的凋亡调节因子进行深度定量和建模计算的结果显示，EOC患者BIM、CASPASE3、BCL-XL基因突变，可以预示对化疗药物的敏感性，而MCL-1、XIAP基因突变，则提示对化疗药物的耐药性[14,16,17,18]。对于难治性或耐药性EOC患者的治疗，迄今仍然是EOC相关研究难点。尽管临床迫切希望将已有的分子生物学证据转化至EOC靶向治疗，但是其前提是：这些基因水平的改变是"可控的"，即基因突变等与EOC之间存在因果关系[18,42]。目前，在对EOC相关研究大量繁衍的生物信息学数据中，可转化为有助于临床治疗EOC的基因突变或信号通路异常的信息仍然十分有限。此外，临床还需要考虑EOC不同亚克隆的异质性特点和特定治疗导致的分子表型演变[43,44]。因此，动态监测EOC的系列性分子标志物水平，也许是更适合该病耐药、复发研究的策略[43,44]。
目前，美国食品和药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)和欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)针对EOC批准上市2种靶向药物，即PARP抑制剂奥拉帕利(olaparib)和抗血管生成类药物贝伐珠单抗(bevacizumab)[45,46,47]。此外，EMA还批准分子靶向药物曲贝替定(trabectedin)用于晚期EOC患者的治疗[47]。该药可以抑制DNA复制和转录，诱发DNA双链断裂(double-strand breaks, DSB)。研究结果显示，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达与EOC耐药和预后相关，VEGF联合化疗可用于复发性EOC患者治疗，虽然不能延长患者总体生存(overall survival, OS)期，但是可以改善该类患者的无进展生存(progression-free survival, PFS)期[48,49]。因此，VEGF抗体亦被建议用于EOC患者治疗。抗血管生成药物应用于EOC治疗中的缺陷之一为缺乏生物标志物，因此难以甄别受益于此类靶向药物的EOC患者[47,48,49,50]。一项Ⅲ期临床试验结果提示，血管生成相关基因抑制、免疫相关基因上调的Ⅱ型EOC的HGSC患者，接受基于铂类药物化疗联合贝伐珠单抗治疗者，较仅接受基于铂类药物化疗者的预后更好[50]。这也体现分子生物学诊断指导EOC精准治疗的应用潜能。PARP抑制剂可以造成DSB，导致BRCA1、2基因的致病性突变，从而影响DNA的HR修复，二者具有协同作用。因此，PARP抑制剂可以使携带BRCA基因突变的EOC细胞死亡[51]。目前正处于研发阶段的其他PARP抑制剂，还包括veliparib、niraparib和rucaparib。文献报道，临床试验结果提示，PARP抑制剂可显著改善EOC患者的PFS期[52,53]。此外，BRCA呈阴性的EOC患者，亦可受益于PARP抑制剂治疗，这可能与HR通路其他基因突变有关[52,53]。
更重要的是，不少研究者利用二代基因测序技术的生物信息数据，探索其他信号通路抑制剂对EOC患者治疗的作用，即使它们可能仅针对部分EOC亚型有效。文献报道，PI3K/AKT/mTOR信号通路中的PIK3CA和PTEN异常表达，与Ⅰ、Ⅱ型EOC均有关[12,54]。mTOR抑制剂不仅针对具有可供预测的生物标志物，还与EOC患者的化疗具有协同作用[55]。在EOC治疗中，针对该通路上游的PI3K和AKT的抑制剂也处于研发阶段，它们可能可以更有效抑制信号传导[56]。肿瘤抑制基因TP53在调节细胞应激反应中起着关键作用，并参与多条与细胞凋亡、周期阻滞和衰老有关的信号通路[57]，并且Ⅱ型EOC的HGSC患者中TP53基因突变率很高，使其具有成为EOC治疗靶点的巨大潜能。因此，p53激活剂kevetrin正被用于晚期实体瘤的研究中[56]。此外，有研究者尝试抑制热休克蛋白90，阻止其与p53形成稳定的复合物，从而使其失去活性，最终导致p53蛋白质增加[58]。目前针对Ⅰ型EOC相关信号通路的药物研究，虽然不及Ⅱ型EOC的深入，但是KRAS和BRAF基因高突变率提示，RAS/RAF/MEK/ERK信号通路有望成为Ⅰ型EOC的有效治疗靶点。研究结果显示，约80%复发性低级别浆液性EOC患者对MEK抑制剂有反应，或经治疗后疾病不再进展[59]。但是，也有研究表明，相较于化疗，MEK抑制剂并不能改善低级别浆液性EOC患者的预后[56]。因此，针对不同治疗靶点的靶向药物在EOC治疗中的临床应用价值，均尚有待进一步探索和验证。
综上所述，EOC无论是在病理形态、临床特征还是分子表型方面，均体现出极高异质性的特点。十多年前，病理学家开始将EOC分为Ⅰ、Ⅱ型EOC，以期了解不同病理类型EOC的来源及其复杂的分子机制。基于二代基因测序技术的基因检测数据，有助于进一步深化对Ⅰ、Ⅱ型EOC异质性特点的认识，揭示不同病理类型EOC可能拥有的特异性分子表型、生物学行为和临床特征。由此可见，综合病理及分子特征进行诊断，可能为EOC患者提供更高效、精准的筛查和治疗策略。
所有作者均声明不存在利益冲突
