探讨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症新生儿G6PD与其基因突变情况。
2017年8月至2019年4月，在上海市儿童医院新生儿筛查中心进行G6PD缺乏症筛查的新生儿为105 766例，初筛G6PD缺乏症呈阳性患儿为217例，选择其中被召回进行G6PD复筛和(或)基因检测的161例新生儿为研究对象。这161例新生儿均接受G6PD复筛，其中146例接受G6PD基因检测。同时对男性患儿及其母亲、女性患儿及其父母(将男性患儿母亲与女性患儿父母统称为患儿家系成员)进行G6PD活性和基因检测，分析患儿及其家系成员G6PD活性、G6PD基因突变位点地域性分布特点，并分析G6PD活性与不同G6PD基因突变位点的关系。采用Mann-Whitney U检验或Kruskal-Wallis H秩和检验，对不同患儿与其家系成员的G6PD活性，以及不同G6PD基因突变位点患儿及其家系成员的G6PD活性进行比较。本研究研究遵循的程序符合2013年新修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求，并与患儿监护人签署临床研究知情同意书。
①本组联合实验室诊断和(或)基因诊断的结果，最终确诊的G6PD缺乏症新生儿为124例(经G6PD活性确诊为121例，G6PD基因检测确诊为113例，二者同时确诊为110例)。②经G6PD活性检测确诊为G6PD缺乏症的121例患儿中，男、女性患儿分别为103、18例。这121例患儿的G6PD活性为0.42 U/g血红蛋白(Hb)(0.35～0.67 U/g Hb)，显著低于其家系成员的1.17 U/g Hb(0.91～1.42 U/g Hb)，男性患儿G6PD活性为0.40 U/g Hb(0.32～0.53 U/g Hb)，显著低于其母亲的1.12 U/g Hb(0.91～1.28 U/g Hb)，女性患儿G6PD活性为1.16 U/g Hb(0.92～ 1.46 U/g Hb)，显著低于其父母的1.74 U/g Hb(0.69～2.80 U/g Hb)，并且上述差异均有统计学意义(Z＝ -9.981、-10.832、-2.021，P<0.001、<0.001、＝0.043)。③本组161例受试儿中，共计146例患儿及其185例家系成员进行G6PD基因检测的结果显示，227例(113例患儿与114例患儿家系成员)携带G6PD基因突变，其中3例为复合型突变，共计检出230个G6PD基因突变位点，前4位为1376G>T、1388G>A、95A>G、1024C>T，占77.8%(179/230)。227例G6PD基因突变携带者的祖籍为福建省、广西壮族自治区、广东省、江西省、四川省及其他地区者分别为43、39、35、34、30与46例，其前2位G6PD基因突变位点分别为1376G>T与1388G>A，1388G>A与1376G>T，871G>A与1024C>T，1388G>A与871G>A，1024C>T与1376G>T，以及1376G>T与1388G>A。④本组前4位G6PD基因突变位点(1376G>T、1388G>A、95A>G、1024C>T)携带者的G6PD活性比较，差异无统计学意义(χ2＝7.642，P＝0.061)。
G6PD活性检测和G6PD基因检测，对G6PD缺乏症患儿都具有诊断意义。G6PD缺乏症患儿及其家系成员G6PD基因突变位点分布具有地域性特点，其G6PD基因突变位点与G6PD活性无明显相关性，临床不能以该病患儿G6PD基因突变位点推测其G6PD活性。
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葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症发病是由于G6PD基因突变，导致G6PD活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起机体溶血性贫血。G6PD缺乏症是最常见导致患者X连锁不完全显性遗传性溶血病，由位于X染色体上的G6PD基因突变导致红细胞戊糖磷酸途径中，谷胱甘肽还原酶的辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生成减少，使得维持红细胞膜稳定性的还原型谷胱甘肽生成减少，而不能抵抗氧化损伤，引起急性溶血性贫血、高胆红素血症，严重者可致胆红素脑病，甚至危及患者生命[1]。该病重在预防，避免G6PD缺乏症患者摄入可能诱发该病的食物及药物，可达到预防该病的目的[2,3]。文献报道，1376G>T、1388G>A、95A>G是中国G6PD缺乏症患者最常见G6PD基因突变位点[4,5,6]。对新生儿进行G6PD筛查，可早期诊断该病患儿。G6PD缺乏症男性患儿和女性纯合子患儿中，G6PD显著缺乏，而部分女性杂合子患儿的G6PD可正常[7]。本研究对2017年8月至2019年4月，在上海市儿童医院新生儿筛查中心接受G6PD缺乏症筛查的105 766例新生儿筛查结果进行分析，并对G6PD缺乏症初筛呈阳性患儿及母亲和(或)父亲进行G6PD复筛和基因检测，旨在为临床诊断该病患儿提供参考依据。现将研究结果报道如下。
2017年8月至2019年4月，在上海市儿童医院新生儿筛查中心接受G6PD缺乏症筛查的新生儿共计105 766例，初筛G6PD缺乏症呈阳性患儿为217例。选择其中被召回进行G6PD复筛和(或)基因检测的161例(男、女性患儿分别为116例与45例)新生儿为研究对象。对这116患儿进行G6PD复筛，而对其中146例患儿(男、女性患儿分别为107例与39例)进行G6PD基因检测。本研究遵循的程序符合2013年新修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求，并与患儿监护人签署临床研究知情同意书。
本研究根据G6PD复筛和(或)G6PD基因突变检测结果，对G6PD缺乏症患儿进行诊断。G6PD缺乏症患儿实验室诊断标准：对于男性受试儿，若其红细胞G6PD活性<2.0 U/g血红蛋白(hemoglobin，Hb)，则判断为G6PD缺乏症；而对于女性患儿，若其红细胞G6PD活性<2.2 U/g Hb，则判断为G6PD缺乏症[8,9]。G6PD缺乏症患儿基因诊断标准：采用荧光定量PCR分析法进行G6PD基因检测，若检测血液样本在对应通道的熔解峰与野生型对照对应熔解峰差异(ΔTm值)在±1 ℃以内，即为野生型峰，诊断为G6PD基因正常；若ΔTm值超过±2 ℃，则为突变型峰，诊断为G6PD缺乏症[10,11]。符合上述G6PD缺乏症实验室或基因诊断标准之一的受试儿，即可被诊断为G6PD缺乏症患儿。
本研究G6PD缺乏症新生儿纳入标准：①出生胎龄为37～42周足月新生儿(自然分娩、剖宫产术分娩)；②出生体重为2 500～4 000 g者；③出生后1 min Apgar评分>7分者；④G6PD缺乏症初筛查呈阳性者；⑤与患儿监护人签署临床研究知情同意书者；⑥临床病例资料完整者。排除标准：①合并其他遗传代谢性疾病或其他先天遗传性疾病新生儿；②已接受可能影响本研究观察指标的其他治疗者；③拒绝参加该研究者。
由于G6PD缺乏症为X连锁不完全显性遗传性溶血病，男性患儿致病基因遗传自其母亲，女性患儿致病基因可能遗传自其父亲和(或)母亲[1]。本研究同时采集男性患儿及其母亲、女性患儿与其父母(将男性患儿母亲与女性患儿父母统称为患儿家系成员)指尖末梢血，滴于S&S903滤纸(美国PerkinElmer公司)上，至完全渗透滤纸，于室温下自然晾干，制作干血滤纸片样本，保存于4 ℃冰箱，用于G6PD活性及基因突变检测。
采用G6PD检测试剂盒(批号：653621，美国PerkinElmer公司)，使用荧光定量PCR分析法，检测干血滤纸片样本的红细胞G6PD活性。其具体检测步骤，严格按照上海市儿童医院新生儿筛查中心实验室建立的标准操作规程进行[12]。
G6PD基因突变检测步骤如下。①DNA提取及其浓度测定：采用Lab-aid824全自动核酸提取仪(厦门致善生物科技股份有限公司)，对制作的干血滤纸片样本进行DNA提取。将4个直径为3 mm干血斑打入试剂管，放入核酸提取仪，套上磁棒套，选择提取程序进行DNA提取。采用紫外-可见光分光光度计，进行DNA提取及其浓度进行检测，DNA样本的A260 nm/A280 nm为1.6～2.0，A260 nm/A230 nm≥2.0，说明DNA提取合格。②多色探针荧光PCR熔解曲线法检测G6PD基因突变：采用G6PD基因突变检测试剂盒(批号：20071401，厦门致善生物科技有限公司)，根据多色探针荧光PCR熔解曲线法的靶序列与探针杂交产物熔点差异，对受试儿的中国人群中常见12种G6PD基因突变型1376G>T、1388G>A、95A>G、1024C>T、871G>A、392G>T、487G>A、1004C>A、1360C>T、383T>C、592C>T、517T>C进行检测。每份检测样本需要通过2个PCR体系完成，每个体系有4种荧光探针。最后，对待测样本与野生型对照对应通道的熔解峰的熔点(Tm值)差值进行计算，判断检测样本是否发生G6PD基因突变[10,11]。
本研究数据采用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。采用Ssize软件，确定满足本研究统计检验的最小样本量。对于呈非正态分布的计量资料，如患儿及其家系成员G6PD活性，采用M(P25～P75)表示，二者比较，采用Mann-WhitneyU检验，4者比较，采用Kruskal-WallisH秩和检验。对于计数资料，如G6PD基因突变型构成比，采用百分比(%)表示。所有统计学检验采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
本研究接受G6PD缺乏症筛查的105 766例新生儿中，G6PD缺乏症初筛结果呈阳性新生儿为217例。最终，召回进行G6PD缺乏症复筛的新生儿为161例，本组初筛结果呈阳性新生儿的召回率为74.2%(161/217)。根据联合实验室诊断和(或)基因诊断结果，G6PD缺乏症新生儿为124例，男、女性患儿分别为103、21例。G6PD缺乏症初筛结果的阳性预测值为77.0%(124/161)，因此未被召回的56例G6PD缺乏症初筛阳性患儿中，预估G6PD缺乏症新生儿为43例，因此本组新生儿的G6PD缺乏症发病率为0.16%[(124＋43)/ 105 766]。
本组161例受试儿进行G6PD复筛后，121例因G6PD复筛仍然呈阳性，而被确诊为G6PD缺乏症患儿，其中男、女性患儿分别为103、18例。这161例患儿的G6PD复筛结果，均显著低于其家系成员，并且差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。其中，仅1例女性患儿父、母亲的G6PD活性均降低，分别为0.35与1.45 U/g Hb。
不同性别患儿及其家系成员G6PD活性比较[U/g Hb，M(P25～P75)]
不同性别患儿及其家系成员G6PD活性比较[U/g Hb，M(P25～P75)]
| 不同性别患儿及其家系成员 | 例数 | G6PD活性 | 不同性别患儿及其家系成员 | 例数 | G6PD活性 | 不同性别患儿及其家系成员 | 例数 | G6PD活性 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 男、女性患儿 | 121 | 0.42(0.35～0.67) | 男性患儿 | 103 | 0.40(0.32～0.53) | 女性患儿 | 18 | 1.16(0.92～1.46) |
| 患儿父、母亲 | 139a | 1.17(0.91～1.42) | 男性患儿母亲 | 103 | 1.12(0.91～1.28) | 女性患儿父、母亲 | 36 | 1.74(0.69～2.80) |
| Z值 | -9.981 | Z值 | -10.832 | Z值 | -2.021 | |||
| P值 | <0.001 | P值 | <0.001 | P值 | 0.043 |
注：a患儿父、母亲中包括103例男性患儿的父亲，18例女性患儿的父、母亲(36例)，故总计为139例。G6PD为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。Hb为血红蛋白。家系成员是指男性患儿父亲，以及女性患儿父、母亲
本组146例接受G6PD基因检测新生儿中，113例为G6PD基因突变者，其中男性患儿为98例，均为半合子纯合突变；女性患儿为15例，其中14例为杂合突变，占93.3%(14/15)，1例为复合型纯合突变(1376G>T与1024C>T)，占6.7%(1/15)。146例患儿的185例家系成员(107例男性患儿的母亲与39例女性患儿的父、母亲)的G6PD基因突变检测结果显示，114例G6PD基因突变。其中，2例男性患儿母亲分别为1024C>T与487G>A、1376G>T与871G>A复合型突变。本组227例(113例患儿与114例家系成员)G6PD基因突变携带者中，总计检出基因突变位点230个，前4位突变位点为1376G>T、1388G>A、95A>G、1024C>T，占77.8%(179/230)。本组227例G6PD基因突变携带者的230个G6PD基因位点分布，见表2。
本组227例G6PD基因突变携带者的230个G6PD基因突位点分布[例数(%)]
本组227例G6PD基因突变携带者的230个G6PD基因突位点分布[例数(%)]
| G6PD基因突变位点 | 构成比 | G6PD基因突变位点 | 构成比 |
|---|---|---|---|
| 1376G>T | 71(30.9) | 487G>A | 5(2.2) |
| 1388G>A | 60(26.1) | 1004C>A | 4(1.7) |
| 95A>G | 24(10.4) | 1360C>T | 4(1.7) |
| 1024C>T | 24(10.4) | 383T>C | 4(1.7) |
| 871G>A | 20(8.7) | 592C>T | 2(0.9) |
| 392G>T | 10(4.3) | 517T>C | 2(0.9) |
注：G6PD为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
根据本组227例G6PD基因突变受试者的突变位点进行祖籍追溯的结果显示，福建省、广西壮族自治区、广东省、江西省、四川省、其他地区者分别为43、39、35、34、30与46例，其前2位突变位点分别为1376G>T与1388G>A，1388G>A与1376G>T，871G>A与1024C>T，1388G>A与871G>A，1024C>T与1376G>T。本组227例G6PD基因突变携带者地区分布，见表3。
本组227例患儿及其家系成员G6PD基因突变携带者地区分布[例数(%)]
本组227例患儿及其家系成员G6PD基因突变携带者地区分布[例数(%)]
| G6PD基因突变位点 | 福建省 | 广西壮族自治区 | 广东省 | 江西省 | 四川省 | 其他地区 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1376G>T | 18(41.9) | 10(25.6) | 6(17.1) | 5(14.7) | 8(26.7) | 13(28.3) |
| 1388G>A | 15(34.9) | 14(35.9) | 5(14.3) | 13(38.2) | 3(10.0) | 8(17.4) |
| 95A>G | 1(2.3) | 7(17.9) | 1(2.9) | 1(2.9) | 4(13.3) | 4(8.7) |
| 1024C>T | 1(2.3) | 1(2.6) | 8(22.9) | 3(8.8) | 9(30.0) | 7(15.2) |
| 871G>A | 1(2.3) | 2(5.1) | 9(25.7) | 7(20.6) | 1(3.3) | 4(8.7) |
| 392G>T | 5(11.6) | 1(2.6) | 1(2.9) | 1(2.9) | 2(6.7) | 3(6.5) |
| 1004C>A | 1(2.3) | 1(2.6) | 1(2.9) | 1(2.9) | 0(0) | 1(2.2) |
| 487G>A | 0(0) | 1(2.6) | 1(2.9) | 1(2.9) | 1(3.3) | 1(2.2) |
| 1360C>T | 0(0) | 1(2.6) | 1(2.9) | 1(2.9) | 1(3.3) | 2(4.3) |
| 383T>C | 0(0) | 1(2.6) | 1(2.9) | 0(0) | 1(3.3) | 2(4.3) |
| 592C>T | 1(2.3) | 0(0) | 1(2.9) | 0(0) | 0(0) | 1(2.2) |
| 517T>C | 0(0) | 0(0) | 0(0) | 1(2.9) | 0(0) | 0(0) |
| 合计 | 43(100.0) | 39(100.0) | 35(100.0) | 34(100.0) | 30(100.0) | 46(100.0) |
注：G6PD为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。家系成员是指男性患儿父亲，以及女性患儿父、母亲
经实验室诊断和(或)基因诊断确诊为G6PD缺乏症的124例患儿中，11例G6PD活性降低(男、女性患儿分别为8例与3例)，均未检出G6PD基因突变；113例检出基因突变患儿中，3例女性患儿G6PD活性正常；根据实验室诊断的G6PD缺乏症为121例，基因诊断的为113例，二者同时确诊的为110例。实验室和(或)基因诊断结果显示，227例患儿及其家系成员携带G6PD基因突变，243例患儿及其家系成员G6PD活性异常，见表4。
实验室和(或)基因诊断对G6PD缺乏症患儿及其家系成员的确诊情况(例)
实验室和(或)基因诊断对G6PD缺乏症患儿及其家系成员的确诊情况(例)
| G6PD缺乏症诊断 | 患儿 | 患儿家系成员 | 合计确诊 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 男性 | 女性 | 合计 | 父亲 | 母亲 | 合计 | ||
| 实验室诊断 | 103 | 18 | 121 | 11 | 111 | 122 | 243 |
| 基因诊断 | 95 | 18 | 113 | 11 | 103 | 114 | 227 |
| 实验室和(或)基因诊断 | 103 | 21 | 124 | 11 | 112 | 123 | 247 |
注：G6PD为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。家系成员是指男性患儿父亲，以及女性患儿父、母亲
本组179例前4位G6PD基因突变位点(1376G>T、1388G>A、95A>G、1024C>T)携带者的G6PD活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本组179例G6PD基因突变位点前4位携带者的G6PD活性比较，见表5。
本组179例G6PD基因突变位点前4位携带者的G6PD活性比较[U/g Hb，M(P25～P75)]
本组179例G6PD基因突变位点前4位携带者的G6PD活性比较[U/g Hb，M(P25～P75)]
| G6PD基因突变位点 | 例数 | G6PD活性 |
|---|---|---|
| 1376G>T | 71 | 0.61(0.35～1.15) |
| 1388G>A | 60 | 0.56(0.40～1.13) |
| 95A>G | 24 | 0.73(0.38～1.17) |
| 1024C>T | 24 | 0.99(0.65～1.25) |
| χ2值 | 7.642 | |
| P值 | 0.061 |
注：G6PD为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，Hb为血红蛋白
G6PD缺乏症是一种常见的X连锁不完全显性遗传病，患者主要分布在非洲热带、中东、东南亚、南美洲部分地区，亚洲热带和亚热带地区，以及地中海部分地区。我国G6PD缺乏症患者发病率分布呈"南高北低"特点，尤其以广东、广西、四川等为高发区域[13,14]。本研究结果显示，本组新生儿的G6PD缺乏症发病率为0.16%(167/105 766)。随着人口流动性增大，上海地区该病发病率显著增高[15]，因此开展新生儿G6PD缺乏症筛查至关重要[16]。
本研究根据实验室检测结果确诊的121例G6PD缺乏症患儿中，男性患儿G6PD活性为0.40 U/g Hb(0.91～1.28 U/g Hb)，仅约为其母亲G6PD活性的1/3；女性患儿为1.16 U/g Hb(0.92～1.46 U/g Hb)，其G6PD活性跨度大，可表现为正常，也可表现为显著缺乏，男性患儿与其母亲G6PD活性，以及女性患儿与其父、母亲G6PD活性分别比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。该病男性患儿G6PD活性更低，较易被临床发现和诊断[17]。
G6PD缺乏症致病基因位于Xq28，由13个外显子及12个内含子组成[18]。本研究227例G6PD缺乏症患儿及其家系成员G6PD基因突变位点主要为1376G>T、1388G>A、95A>G、1024C>T，占77.8%(179/230)。这与文献报相似[19]。本组227例G6PD缺乏症患儿及其家系成员的祖籍为福建省、广西壮族自治区、广东省、江西省、四川省、其他地区者分别为43、39、35、34、30与46例，其前2位突变位点为1376G>T与1388G>A，1388G>A与1376G>T，871G>A与1024C>T，1388G>A与871G>A，1024C>T与1376G>T。这亦与文献报道相符[20]。
本组11例患儿实验室检查结果显示G6PD活性降低(男、女性患儿分别为8例与3例)，但是基因检测结果正常；而3例女性患儿基因检测发现G6PD基因位点突变，但是实验室检查结果正常。这提示，上述2种方法联合使用，可提高G6PD缺乏症患儿诊断准确性。文献报道，G6PD基因检测较G6PD活性检测，对女性杂合子G6PD缺乏症检出，更具有优势[21]。男性半合子和女性纯合子G6PD缺乏症患者常表现为G6PD活性显著缺乏。因此，G6PD活性检测对有临床症状的G6PD基因纯合突变者具有诊断价值，而对于没有临床症状的杂合突变患者，则需要通过基因检测进行诊断。
本组G6PD基因突变位点前4位携带者的G6PD活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。这提示，G6PD缺乏症患儿的G6PD活性与其G6PD基因型没有相关性，临床不能根据G6PD缺乏症患儿G6PD基因型推测其G6PD活性。
综上所述，荧光定量PCR分析法和多色探针荧光PCR熔解曲线法，对G6PD缺乏症患儿都具有诊断意义。G6PD基因检测较G6PD活性检测，在女性杂合子G6PD缺乏症患儿中的检出更具有优势。G6PD基因突变具有地域性分布特点，并且各突变位点与G6PD活性无明显相关性。
所有作者均声明不存在利益冲突
