探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与血清叶酸水平，对妊娠期糖尿病(GDM)患者及其妊娠结局的影响。
选择2016年12月至2018年12月，于青岛市城阳人民医院进行产前检查的568例GDM患者为研究对象，并将其纳入GDM组。选择同期在该院进行产前检查的674例健康孕妇纳入对照组。采用荧光定量聚合酶链反应(fqPCR)技术，分析所有受试者MTHFR基因C677T、A1298C位点基因型，同时检测其血清叶酸水平。采用χ2检验，对2组受试者MTHFR基因C677T及A1298C位点等位基因及基因型分布，以及不同妊娠结局GDM孕妇C677T位点基因型分布进行比较；采用t检验、单因素方差分析及最小显著性差异(LSD)-t检验，比较不同妊娠结局GDM患者血清叶酸水平，对2组MTHFR基因C667T位点3个基因型受试者的血清叶酸水平进行组内及组间比较；采用受试者工作特征(ROC)曲线，对C667T位点不同基因型联合血清叶酸水平，对于GDM预测价值进行分析。本研究遵循的程序经青岛市城阳人民医院伦理委员会批准[审批文号：(2015年)伦理批第(11)号)]，并与所有受试者签署研究知情同意书。
①GDM组受试者MTHFR基因C667T位点等位基因C的频率显著高于对照组(70.9% vs 61.5%，χ2＝24.483、P<0.001)，该位点基因型以CC为主，而对照组则以CT为主。2组受试者MTHFR基因A1298C位点的等位基因(A/C)及基因型(AA/AC/CC)分布比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)，并且2组均以A等位基因及AA基因型为主。②2组均为MTHFR基因C667T位点为CC、CT、TT 3种基因型受试者的血清叶酸水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中CC基因型受试者血清叶酸水平显著高于TT基因型者，并且差异有统计学意义(P<0.001)。③GDM组MTHFR基因C667T位点为CC、CT及TT基因型受试者的血清叶酸水平为(16.4±2.4) nmoL/L、(14.6±3.8) nmoL/L及(12.4±3.1) nmoL/L，均显著低于对照组的(20.4±2.5) nmoL/L、(18.5±3.4) nmoL/L及(16.3±3.0) nmoL/L，并且差异均有统计学意义(t＝28.040、19.292、22.869，均为P<0.001)。④MTHFR基因C667T位点不同基因型联合血清叶酸水平预测GDM的ROC曲线下面积为0.816(P<0.05)。⑤GDM组发生不良妊娠结局受试者MTHFR基因C667T位点CC基因型频率(32.5%)及血清叶酸水平[(13.3±4.2) nmoL/L]，均显著低于未发生不良妊娠结局者[42.3%、(15.9±4.0) nmoL/L]，而TT基因型频率(25.3%)则显著高于未发生不良妊娠结局者(17.8%)，并且差异均有统计学意义(χ2＝5.626、P＝0.018，t＝7.446、P<0.001，χ2＝4.680、P＝0.031)。
GDM患者MTHFR基因C667T位点CC基因型占比较高，并且血清叶酸水平较健康孕妇低。MTHFR基因C667T位点基因型和血清叶酸水平，与GDM患者的妊娠结局有关。
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营养过剩使妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus, GDM)成为全球孕产妇的常见流行病，全世界孕产妇的GDM患病率为12.9%[1]。对于孕产妇而言，GDM与不良妊娠结局及产后2型糖尿病的发生有关[2]。GDM患者的后代，容易罹患儿童肥胖症和2型糖尿病[3]。因此，识别GDM的潜在、可改变危险因素，是提高孕产妇及其子女健康水平的很有前途的策略。叶酸是一种广泛存在于绿色蔬菜、水果和豆类等食物中的B族维生素[4]。文献报道，若叶酸摄入量低，会导致机体同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高，从而造成机体胰岛素抵抗、血脂异常和肝损伤等代谢紊乱性疾病发生[5]。这些代谢紊乱与GDM发病机制有关。Hcy是蛋氨酸代谢中起着重要作用的含硫氨基酸[6]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)通过降低血清Hcy含量，而在Hcy代谢中起着关键作用[7]。徐旭赟和黄美英[8]研究结果显示，GDM患者血清Hcy水平高于正常孕妇，而MTHFR基因多态性，可能通过影响血清Hcy水平而对GDM的发生、发展产生影响。MTHFR基因常见的2个多态性位点为C677T和A1298C。同时，血清叶酸水平增加是否对GDM发生具有潜在影响作用，也引起研究者的关注。本研究拟检测受试者的MTHFR基因多态性及血清叶酸水平，探讨以上指标对GDM患者及其妊娠结局的影响。现将研究结果报道如下。
选择2016年12月至2018年12月，于青岛市城阳人民医院进行产前检查的568例GDM患者为研究对象，将其纳入GDM组，其孕龄为19～25孕周，年龄为24～36岁，平均为28.33岁。选择同期在该医院进行产前检查的674例健康孕妇纳入对照组，其孕龄为19～25孕周，年龄为25～35岁，平均为28.46岁。本研究遵循的程序经青岛市城阳人民医院伦理委员会批准[审批文号：(2015年)伦理批第(11)号)]。所有受试者均签署知情同意书。
本研究纳入标准：①对GDM组孕妇的诊断均符合GDM诊断标准，即第1次产前检查时的空腹血糖浓度≥5.5 mmol/L，或孕龄为24～28孕周时的75 g口服葡萄糖耐量试验后2 h血糖浓度≥8.0 mmol/L；②2组孕妇均无吸烟及酗酒史；③2组孕妇均经妇科及超声检查等，排除生殖系统解剖结构畸形。④2组孕妇随访资料均完整。排除标准：①孕前罹患其他内科慢性病者；②多胎妊娠者；③伴妊娠期高血压疾病、子痫前期、羊水过少或过多者；④孕前伴有糖尿病者；⑤具有家族性遗传病史者；⑥罹患甲状腺功能亢进/减退等，可能影响本研究结果的疾病者；⑦失访者。
采集所有受试者的肘静脉血2 mL，置于乙二胺四乙酸中，送至本院检验科，分离血清，于4 ℃可保存3 d，若需长期保存则-20 ℃冻存，用以筛查受试者MTHFR基因突变。MTHFR基因多态性分析主要步骤依次如下。①外周血基因组DNA提取：采用QIAGEN全血基因组DNA试剂盒(批号为：51504，德国QIAGEN公司)，提取所有受试者外周血基因组DNA。②目的基因扩增：采用等位基因特异性荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，fqPCR)技术，在ABI 7900型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上，对目的基因进行扩增。其中，MTHFR基因C677T、A1298C位点参考序列，均下载自http：//grch37.ensembl.org/index.html，由笔者采用primer 5软件进行引物设计，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。MTHFR基因C677T位点引物序列的正向引物为5′-AAGCTGCGTGATGATGAAATCG-3′，反向引物为5′-CTCCCGCAGACCTTCTCC-3′；A1298C位点引物序列的正向引物为5′-CTTTGGGGAGCTGAAGGACATCATC-3′，反向引物为5′-CACTTTGTGACCATTCCGGT TTG-3′；内参β-actin基因的正向引物为5′-GGCAVVVAGCACAATGAAG-3′，反向引物为5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′。上述PCR的所有操作，由2位生物分子学专业人员(包括笔者)严格按照试剂盒说明书进行。③MTHFR基因的基因型分析，即MTHFR基因2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点fqPCR检测结果(图1)，纵坐标ΔRn＝每点测量的荧光强度-荧光基线强度，横坐标cycle表示每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；红色线条为内参β-actin的ΔRn值，蓝色线条为C677T位点C等位基因(或A1298C位点A等位基因)的ΔRn值，绿色线条为C677T位点T等位基因(或A1298C位点C等位基因)的ΔRn值。若检测样本为C677T CC基因型，则fqPCR检测结果图显示C等位基因ΔRn值呈对数增长，而T等位基因ΔRn值不增加(呈与横轴平行的直线)(图1A)；若检测样本为C677T CT基因型，则fqPCR检测结果图显示C及T等位基因的ΔRn值均呈对数增长(图1B)。MTHFR基因A1298C位点检测结果判定方法与C677T位点类似，见图1C，图1D。
注：MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶，fqPCR为荧光定量聚合酶链反应。纵坐标ΔRn＝每点测量的荧光强度-荧光基线强度；横坐标为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。红色线条为内参β-actin，蓝色线条为C677T位点C等位基因或A1298C位点A等位因，绿色线条为C677T位点T等位基因或A1298C位点C等位基因
晨起抽取孕妇空腹肘静脉血4 mL，送至本院检验科，采用放射免疫法，于Unicel DXI 800化学发光分析仪(美国贝克曼库尔特公司)上，检测受试者血清叶酸水平。血清叶酸水平的正常值为11～54 nmoL/L。
本研究受试者不良妊娠结局主要包括：自然流产、胎儿畸形、早产、先兆流产、子痫前期及死胎等。
本研究数据资料采用SPSS 22.0统计学软件包进行统计学处理。对血清叶酸水平等呈正态分布的计量资料，采用
±s表示；对2组计量资料比较，采用成组t检验，3者比较则采用单因素方差分析，并采用最小显著性差异(least significant difference, LSD)-t检验进行两两比较。对等位基因频率、基因型频率等计数资料，采用百分比(%)表示，组间比较采用χ2检验。采用受试者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲线，对C667T位点不同基因型联合血清叶酸水平，对GDM的预测价值进行分析。所有统计学检验采用双侧检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2组受试者MTHFR基因2个SNP位点C667T与A1298C的基因型分布，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(均为P>0.05)，在本研究人群(2组受试者)中处于遗传平衡状态。2组受试者MTHFR基因2个SNP位点基因型分布，见表1。
2组受试者MTHFR基因2个SNP位点等位基因及基因型分布比较[例数(%)]
2组受试者MTHFR基因2个SNP位点等位基因及基因型分布比较[例数(%)]
| 组别 | 例数 | C667T位点 | A1298C位点 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 等位基因 | 基因型 | 等位基因 | 基因型 | ||||||||
| C | T | CC | CT | TT | A | C | AA | AC | CC | ||
| GDM组 | 568 | 806(70.9) | 330(29.1) | 293(51.6) | 220(38.7) | 55(9.7) | 878(77.3) | 258(22.7) | 340(59.8) | 198(34.9) | 30(5.3) |
| 对照组 | 674 | 829(61.5) | 519(38.5) | 258(38.3) | 313(46.4) | 103(15.3) | 1 047(77.7) | 301(22.3) | 405(60.0) | 237(35.2) | 32(4.8) |
| χ2值 | 24.483 | 24.162 | 0.052 | 0.187 | |||||||
| P值 | <0.001 | <0.001 | 0.820 | 0.665 | |||||||
注：GDM组为妊娠期糖尿病孕妇，对照组为健康孕妇。GDM为妊娠期糖尿病，MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶，SNP为单核苷酸多态性。等位基因频率(%)＝[该种等位基因观察数/(2×观察总数)]×100%，基因型频率(%)＝(该种基因型观察数/观察总数)×100%
GDM组受试者MTHFR基因C667T位点等位基因(C/T)及基因型(CC/CT/TT)分布比较，差异均有统计学意义(均为P<0.001)。其中，GDM组受试者MTHFR基因C667T位点等位基因C的频率显著高于对照组，基因型以CC为主，对照组该位点基因型以CT为主。2组受试者MTHFR基因A1298C位点的等位基因(A/C)及基因型(AA/AC/CC)分布比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)，2组均以A等位基因及AA基因型为主。2组受试者MTHFR基因2个SNP位点等位基因及基因型分布比较，见表1。
由于2组受试者MTHFR基因A1298C位点的基因型分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，故仅对该基因的C667T位点进行进一步分析。①2组MTHFR基因C667T位点均为，CC、CT、TT 3种基因型受试者的血清叶酸水平(组内)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；并且2组均为CC基因型受试者血清叶酸水平，显著高于TT基因型者，并且差异有统计学意义(P<0.001)。②GDM组MTHFR基因C667T位点为，CC、CT、TT基因型受试者的血清叶酸水平，均显著低于对照组，并且差异均有统计学意义(P<0.001)。2组MTHFR基因C667T位点3个基因型受试者的血清叶酸水平组内及组间比较，见表2。③MTHFR基因C667T位点不同基因型联合血清叶酸水平预测GDM的ROC曲线下面积为0.816(P<0.05)，(见图2)。
2组MTHFR基因C667T位点3个基因型受试者的血清叶酸水平组内及组间比较(nmoL/L，
±s)
2组MTHFR基因C667T位点3个基因型受试者的血清叶酸水平组内及组间比较(nmoL/L，±s)
| 组别 | 例数 | CC | CT | TT | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| GDM组 | 568 | 16.4±2.4 | 14.6±3.8 | 12.4±3.1 | 10.384 | <0.001 |
| 对照组 | 674 | 20.4±2.5 | 18.5±3.4 | 16.3±3.0 | 8.732 | <0.001 |
| t值 | 28.040 | 19.292 | 22.869 | |||
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：MTHFR基因C667T位点CC基因型受试者血清叶酸水平vs TT基因型受试者血清叶酸水平：①GDM组为t＝10.793、P<0.001；②对照组为t＝13.266、P<0.001。GDM组为妊娠期糖尿病孕妇，对照组为健康孕妇。MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶，GDM为妊娠期糖尿病
注：MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶，GDM为妊娠期糖尿病。ROC曲线为受试者工作特征曲线
GDM组发生不良妊娠结局受试者MTHFR基因C667T位点CC基因型频率及血清叶酸水平，均显著低于未发生不良妊娠结局者，而TT基因型频率，则显著高于未发生不良妊娠结局者，并且差异均有统计学意义(P<0.05)。GDM组发生与未发生不良妊娠结局受试者的MTHFR基因C667T位点CT基因型频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。GDM组发生与未发生不良妊娠结局受试者的MTHFR基因C667T位点基因型频率、血清叶酸水平比较，见表3。
GDM组发生与未发生不良妊娠结局受试者的MTHFR基因C667T位点基因型频率、血清叶酸水平比较
GDM组发生与未发生不良妊娠结局受试者的MTHFR基因C667T位点基因型频率、血清叶酸水平比较
| 不良妊娠结局 | 例数 | 基因型频率[例数(%)] | 血清叶酸水平(nmoL/L， ±s) | ||
|---|---|---|---|---|---|
| CC | CT | TT | |||
| 发生 | 237 | 77(32.5) | 100(42.2) | 60(25.3) | 13.3±4.2 |
| 未发生 | 331 | 140(42.3) | 132(39.9) | 59(17.8) | 15.9±4.0 |
| 检验值 | χ2＝5.626 | χ2＝0.306 | χ2＝4.680 | t＝7.446 | |
| P值 | 0.018 | 0.580 | 0.031 | <0.001 | |
注：本研究不良妊娠结局包括自然流产、胎儿畸形、早产、先兆流产、子痫前期及死胎等。GDM为妊娠期糖尿病，MTHFR为亚甲基四氢叶酸还原酶
在生物体中，蛋白质、核苷酸、泛酸的合成及分子甲基化均需要一碳单位参与，而叶酸是一碳单位代谢过程中的辅助因子，如MTHFR参与一碳循环，对DNA、细胞膜、蛋白质和脂质的核苷酸合成及甲基化起重要作用。目前，关于叶酸代谢相关基因的变异已被广泛研究[9,10]。饮食中叶酸含量过低，或者由于特定的遗传缺陷而增加对叶酸的代谢需求，可导致叶酸缺乏。在过去的几十年里，许多国家建议育龄妇女服用叶酸补充剂，从而增加孕妇的血清叶酸水平，以预防胎儿神经管缺陷等不良妊娠结局发生[11,12,13]。但是，对于叶酸摄入量较高是否与GDM风险较低相关，目前尚不明确。GDM是常见的妊娠期并发症，不仅与不良围生期结局有关，还与母亲及其后代的长期心脏代谢疾病的发生风险有关[14]。明确与GDM发病可能的危险因素，才能有针对性地对孕产妇进行孕期保健指导，并且可能改善孕产妇及其胎儿的妊娠结局。
MTHFR基因常见的2个多态性位点为C677T和A1298C，在叶酸代谢中起着重要作用，对这2个位点进行分析，可有助于叶酸缺乏患者更好地补充和利用叶酸。MTHFR基因C677T位点C-T突变，可能升高血清Hcy水平，并且与胎儿神经系统畸形和囊性脊柱裂有关，还可能对胎儿发育的其他方面造成影响[15]。MTHFR基因A1298C位点A-C突变，在孕期与C677T位点C-T突变有相似作用。Lin等[16]研究结果显示，MTHFR基因多态性可能在Down综合征的易感性机制中起作用。迄今为止，MTHFR基因SNP联合血清叶酸水平与GDM发生的关系，尚未完全阐明。本研究结果显示，GDM患者MTHFR基因C667T位点等位基因(C/T)及3种基因型(CC/CT/TT)分布与健康孕妇比较，差异有统计学意义(P<0.001)，即GDM患者等位基因T及基因型TT的频率均低于健康孕妇。MTHFR基因A1298C位点等位基因(A/C)及3种基因型(AA/AC/CC)分布与健康孕妇比较，差异无统计学意义(P>0.05)，这提示该位点可能不是导致孕妇发生GDM的危险因素。本研究结果还显示，GDM及健康孕妇均为MTHFR基因C667T位点的CC/CT/TT基因型与血清叶酸水平相关，即CC基因型孕妇血清叶酸水平最高，TT基因型孕妇血清叶酸水平最低；并且这3个基因型GDM患者的血清叶酸水平，均显著低于健康孕妇，这提示MTHFR基因C667T位点各个基因型，对GDM患者的血清叶酸水平影响更大。
Sayyah-Melli等[17]研究结果显示，叶酸缺乏和高Hcy浓度，与育龄女性习惯性自然流产增加和严重妊娠并发症，包括妊娠期高血压疾病、子痫前期及胎盘早剥的发生有关。此外，母体血清叶酸水平对胚胎发育有显著影响，如叶酸可以减轻由GDM引起的大鼠胚胎发育不良[18]。叶酸还可以提高体内一氧化氮(NO)水平，对2型糖尿病相关的内皮功能障碍具有改善作用[19]。MTHFR基因多态性引起的高Hcy血症，可能导致胎盘绒毛间隙细胞成分被破坏，影响母胎相互作用[20]。参与母胎相互作用的细胞成分，如合体滋养层细胞、蜕膜表面上皮细胞、螺旋静脉内皮细胞和覆盖螺旋动脉末端的血管内滋养层细胞被破坏，均可能引起炎症过程，从而可能导致孕产妇围生期/产科并发症的发生[21]。本研究结果显示，发生不良妊娠结局的GDM患者MTHFR基因C667T位点的CC基因型频率低于、TT基因型频率高于未发生不良妊娠结局者，并且其血清叶酸水平亦低于未发生不良妊娠结局者。这提示，MTHFR基因C677T位点多态性和血清叶酸水平，可能与不良妊娠结局有关。此外，本研究结果还显示，MTHFR基因C667T位点不同基因型联合血清叶酸水平预测GDM的ROC曲线下面积为0.816(P<0.05)。提示采用MTHFR基因C667T位点多态性联合血清叶酸水平，对GDM的预测价值较高。
根据本研究结果，GDM患者MTHFR基因C667T位点CC基因型的占比较高，并且血清叶酸水平较健康孕妇更低。GDM患者妊娠结局与MTHFR基因C667T位点基因型和血清叶酸水平相关。
所有作者均声明不存在利益冲突
