探讨谷胱甘肽合成酶缺乏症(GSSD)患儿的临床特征及谷胱甘肽合酶(GSS)基因突变特点。
选择2017年9月，于中山大学附属第六医院确诊的1例GSSD患儿为研究对象。回顾性分析其临床表现、实验室检查及基因检测结果等临床病例资料。以"谷胱甘肽合成酶缺乏症""焦谷氨酸尿症""glutathione synthase deficiency""GSSD"为关键词，对万方数据知识服务平台及PubMed数据库，自2010年1月至2020年5月收录的关于GSSD患儿诊治研究相关文献进行检索，并总结GSSD患儿的临床表现和基因突变特点。本研究经中山大学附属第六医院伦理委员会批准(审批文号：2017ZSLYEC-105)，患儿监护人签署知情同意书。
①临床特点及转归：本例患儿为女性，4 d龄，因"生后进行性呼吸困难4 d"入院。患儿临床表现为中度贫血、重度代谢性酸中毒、焦谷氨酸尿症及中枢神经系统影像学改变，并有类似GSSD临床表现的家族史(其同胞姐姐4 d龄时发病，放弃治疗后50+ d龄时死亡)。经治疗后，本例患儿呼吸困难缓解，但仍然存在代谢性酸中毒。经基因检测确诊为GSSD(重型)后，监护人放弃治疗，患儿于2个月龄时死亡。②基因检测结果：本例患儿为GSS基因c.491G>A和c.800G>A复合杂合突变，分别遗传自母亲和父亲。③文献复习结果：检索到10篇关于GSSD患儿诊治研究相关文献，共计纳入15例GSSD患儿，包括轻、中、重型GSSD各为2、2、11例。轻、中型患儿(共4例)经早期诊断、积极干预达临床治愈；重型患儿(11例)中，3例生后5个月内死亡，8例存活儿均遗留神经系统后遗症。12例患儿接受基因检测的结果显示，共检出11种GSS基因突变，其中6例检出GSS基因c.491G>A突变患儿的临床表型均为中或重型。
GSSD临床表现具有特异性，可有家族遗传性。该病由GSS基因突变所致，其基因突变类型与临床表型的关系，尚需进一步研究。早期诊断及治疗，可提高该病患者生存率、改善长期预后。
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谷胱甘肽合成酶缺乏症(glutathione synthetase deficiency，GSSD)是罕见的常染色体隐性遗传性疾病，为谷胱甘肽合酶(glutathione synthase，GSS)基因突变所致[1]。GSSD患儿主要表现为溶血性贫血、代谢性酸中毒、焦谷氨酸尿症、进行性神经系统疾病症状等。全球已有50+个家族的超过80例该病患者被文献报道，并且GSS基因突变是GSSD的致病原因[2]。本研究对1例GSSD患儿家系进行GSS基因突变分析，并针对该病患儿诊治研究相关文献进行复习，旨在探讨该病遗传学致病原因，为家系遗传咨询、产前诊断提供依据。现将研究结果报道如下。
选择2017年7月，于中山大学附属第六医院确诊的1例GSSD患儿为研究对象。本研究遵循的程序经中山大学附属第六医院伦理委员会批准(审批文号：2017ZSLYEC-105)，与患儿监护人均签署临床研究知情同意书。
本例GSSD患儿的临床诊断、基因诊断及GSSD胎儿的产前诊断与GSSD患儿分型标准[1]如下。①临床诊断标准：若临床表现为黄疸、溶血性贫血、代谢性酸中毒，尿有机酸分析检出焦谷氨酸水平高患儿，红细胞GSS活性测定提示降低或缺乏(其正常值范围视检测方法和仪器而异)，则临床诊断为GSSD患儿。②基因诊断标准：临床诊断为GSSD患儿，若GSS基因分析检出致病性基因突变，则可被确诊为GSSD患儿。③产前诊断标准：若孕妇羊水穿刺检测结果显示，羊膜细胞GSS活性降低或缺乏，或者测定羊水中焦谷氨酸水平升高，则可被诊断为胎儿GSSD。④GSSD患儿分型标准：根据GSSD患儿临床症状，可将GSSD分为轻、中、重型。轻型GSSD患儿仅表现为孤立性、可代偿性溶血性贫血；中型则表现为溶血性贫血、难以纠正的代谢性酸中毒及焦谷氨酸尿症；重型则除了存在上述临床表现外，同时还合并中枢神经系统损害[1]。
经患儿监护人知情同意后，抽取患儿及其父母静脉血各2 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝，由广州嘉检医学检测有限公司，使用Illumina Nextseq 500测序平台进行GSS基因二代测序。①筛选致病性基因突变：将测序结果参考生物信息学方法进行数据分析。首先，筛选高质量变异，即对变异数据进行质控，去除测序覆盖深度低于20 x的低质量变异，以减少基因突变的假阳性率及测序错误率。其次，对比基因数据库，包括该公司的内部数据库、dbSNP(http：//www3.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)、ESP6500数据库(http：//evs.gs.washington.edu/EVS/)、ExAC数据库(http：//exac.broadinstitute.org)等，找出可能引起氨基酸改变的基因突变，标注突变基因的单核苷酸多态性和低频良性突变。第3，应用Alamut™2.15预测软件，对所检测基因突变的保守性、致病性、危害性进行预测，推测基因突变对蛋白质的结构和功能可能造成的改变。②确定致病性基因突变并分类：首先，检索人类基因突变数据库(Human Gene Mutation Database，HGMD)(http：//www.hgmd.cf.ac.uk/)、PubMed、Clinvar等数据库，并对GSS基因突变相关文献进行分析，确认筛选出的致病性基因突变是否被报道及其致病性。然后，将前述步骤所获得的信息，包括基因突变类型、氨基酸改变、蛋白质结构和(或)功能改变、既往被报道情况等，参考美国医学遗传学和基因组大学(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMGG)基因突变分类指南，最终确定本例患儿GSS基因突变的致病性、该突变在参考HGMD中的变异频率，并确定本例患儿GSSD的致病突变位点、是否为已知突变。
以"谷胱甘肽合成酶缺乏症""焦谷氨酸尿症""glutathione synthase deficiency""GSSD"为关键词，对万方数据知识服务平台及PubMed数据库收录的关于GSSD患儿诊治研究文献进行检索。本次检索时间设定为2010年1月至2020年5月。
采用回顾性分析方法，对本例GSSD患儿临床病例资料相关数据进行分析。对检索到的GSSD患儿诊治研究相关文献进行复习，总结该病的临床特点、诊治原则及基因突变特点。
本例患儿为4 d龄女婴，因"生后进行性呼吸困难4 d"，于中山大学附属第一医院惠亚医院住院治疗。患儿系G2P2，出生胎龄为40+1周，因"宫内窘迫"剖宫产娩出，出生体重为3.1 kg，身长为48 cm，出生情况及Apgar评分均良好。患儿生后1 d逐渐出现呼吸急促，进行性加重，并出现呻吟、三凹征等呼吸困难表现。入院查体：呼吸频率为82次/min，心率为160次/min，血氧饱和度(blood oxygen saturation，SO2)为90%，足月儿貌，皮肤苍黄，前囟平软，唇周发绀，呼吸急促，伴呻吟，三凹征(+)，双肺呼吸音粗，未闻及干、湿性啰音；心音有力，律齐，各瓣膜听诊区未闻及杂音；腹部查体无异常；四肢肌张力稍高。本例患儿的入院诊断：新生儿呼吸困难原因待查。
本例患儿父母均无异常表现，为非近亲结婚。母亲第1次妊娠时合并妊娠期糖尿病，G1P1为女性(本例患儿同胞姐姐)，5年前出生，生后4 d龄因"气促2+ d"至当地医院住院治疗，被诊断为"新生儿胎粪吸入综合征，焦谷氨酸尿症，地中海贫血"，因代谢性酸中毒等临床症状难以被纠正，监护人放弃治疗自动出院后，于生后50+ d死亡。
本例患儿入院后主要检查结果如下。①实验室检查结果：血常规示白细胞为11.92×109/L，中性粒细胞百分比为59.2%，血红蛋白为107 g/L(降低)，C反应蛋白为10.7 mg/L，未检测网织红细胞相关指标。血型为O型，RhD+。血气分析(静脉血)示pH值为6.99(降低)，乳酸为3.1 mmol/L(升高)，HCO3-为6.5 mmol/L(降低)，碱剩余为-23.8 mmol/L(降低)；治疗6 d后复查血气分析(动脉血)示pH值为7.36，二氧化碳分压为23 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)(降低)，氧分压为79 mmHg，乳酸为2.2 mmol/L，HCO3-为13 mmol/L(降低)，碱剩余为-10.7 mmol/L(降低)，SO2为95%。血氨为26.6 μmol/L。总胆红素为143 μmol/L，未结合胆红素为141 μmol/L。血K+为5.86 mmol/L(升高)、Na+为145 mmol/L。②其检查结果：尿有机酸分析示焦他谷氨酸显著增高(图1)。心脏彩色多普勒超声检查示卵圆孔未闭(3.9 mm)。胸部X射线摄片检查示双肺纹理增粗。头颅MRI检查示双侧额叶皮质下多发斑片状异常信号影。
注：GSSD为谷胱甘肽合成酶缺乏症
本例患儿治疗、转归及基因检测结果与结局如下。①入院治疗：对其给予连续气道正压通气辅助治疗(低流量给氧)、抗感染治疗、补碱等。②转归：治疗7 d后，患儿呼吸困难缓解，但仍然存在代谢性酸中毒，最终监护人自愿放弃住院治疗。患儿出院诊断为"遗传代谢性疾病、代谢性酸中毒、新生儿感染、中度贫血、高钾血症、卵圆孔未闭"。③基因检测结果及结局：出院后，监护人带患儿至中山大学附属第六医院儿科门诊就诊，门诊医师高度怀疑患儿为GSSD，故对患儿及其父母进行GSS基因检测。本例患儿的二代测序结果显示，GSS基因存在复合杂合突变，分别为c.491G>A(遗传自母亲)及c.800G>A(遗传自父亲)。参考HGMD，确定本例患儿遗传自父母的2个GSS基因突变频率均很低(<0.001)。蛋白质功能实验显示，c.491G>A突变可以引起外显子剪接功能异常，突变所在区域为相应蛋白质的重要组成部分；c.800G>A突变仅引起氨基酸序列改变。经计算机辅助分析、预测，这2个突变均可能对相应蛋白质结构和(或)功能产生影响。依据ACMGG突变分类指南，这2个基因突变均为"Ⅱ类(可能致病)"，并且这2个突变位点，均为HGMD的已知突变。因此，确定这2个突变为导致本例患儿GSSD的致病突变位点。患儿GSS基因检测报告，见表1。④结局：最终患儿被确诊为GSSD后，监护人再次放弃治疗，患儿于2个月龄时死亡。
本例GSSD患儿GSS基因检测报告
本例GSSD患儿GSS基因检测报告
| 基因名称 | OMIM编号 | HG19位置 | 转录本 | 核苷酸突变(氨基酸改变) | ACMGG变异分类 | 疾病名称/是否已知突变 | 来源 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| GSS | 601002 | chr20：33530291 | NM_000178 | c.491G>A(p.R164？) | Ⅱ类(可能致病) | GSSD/是 | 母亲(杂合) |
| GSS | 601002 | chr20: 33523413 | NM_000178 | c.800G>A(p.R267Q) | Ⅱ类(可能致病) | GSSD/是 | 父亲(杂合) |
注：本例患儿2个GSS基因突变均为杂合突变，突变频率均为<0.001，均为常染色体隐性遗传。GSSD为谷胱甘肽合成酶缺乏症，GSS为谷胱甘肽合酶。OMIM为在线人类孟德尔遗传，HG19为人类基因组19，ACMGG为美国医学遗传学和基因组大学
按照本研究设定的文献检索策略，检索到GSSD患儿诊治研究的文献共计10篇[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]，包括2篇中文文献(3例)及8篇英文文献(12例)，纳入研究为15例GSSD患儿。这15例患儿的发病年龄为1 d至1岁，以气促、黄疸、贫血等起病，除1例轻型GSSD患儿仅有孤立性溶血外，其他患儿临床表现均有溶血性贫血、代谢性酸中毒及焦谷氨酸尿症。这15例患儿中，轻、中、重型GSSD患儿各为2、2、11例。其中，2例轻型GSSD患儿预后均良好，2例中型患儿均临床治愈，但文献均未报道其后续发育情况，重型患儿3例在生后5个月内死亡，另8例存活儿均遗留神经系统后遗症，如癫痫、脑白质软化、精神运动发育迟滞等。15例临床诊断的GSSD患儿中，12例进一步接受基因检测结果提示，均存在GSS基因突变，分别为c.491G>A、c.800G>A、c.1252C>T、c.374G>A、c.656A>G、c.902T>C、c.847C>T、c.446-447del、c.129+1663A>G、c.738dupG及Chr20：33530733-33530809，共计11种。其中，c.491G>A(纯合突变或复合杂合突变)为GSSD患儿的最常见GSS基因突变，6例患儿均被检出该突变类型，而且其均为中或重型GSSD患儿。
GSS基因定位于20q.11.2，包括13个外显子。据HGMD统计，目前已有33种类型的GSS基因突变被文献报道，最常见为错义或无义突变、剪接突变，亦有小缺失、插入等。其中，剪接突变通过基因序列分析无法被识别，需采用逆转录聚合酶链反应技术进行检测[12]。GSS基因发生突变，可导致GSS缺乏或活性降低，使机体谷胱甘肽(glutathion, GSH)合成不足[1,3,13]。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，几乎存在于哺乳动物的每个细胞并发挥重要生理功能，如促进蛋白质和DNA合成及转运、摄入物质的解毒及代谢、防御自由基或其他氧化应激损伤等[1,9]。GSH对维持红细胞膜完整性具有至关重要作用，其合成不足使红细胞更易受到氧化损伤，从而发生溶血性贫血[3,9]。GSH在谷氨酰循环中，由γ谷氨酰半胱氨酸经GSS催化合成，GSS缺乏则可造成GSH合成减少，而γ谷氨酰半胱氨酸累积，使其经γ谷氨酰环化转移酶水解的产物半胱氨酸及焦谷氨酸堆积，大量焦谷氨酸则随尿液排出体外[1]。此外，GSH还被认为是一种神经调质和神经递质，GSH缺乏可能使肌原纤维蛋白受体的氧化还原调节功能、防止谷氨酸神经毒性的相关神经保护机制及GSH特有的神经递质功能发生改变，从而导致神经元死亡及神经系统疾病[14]。
GSSD(MIM 266130)是一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，根据患儿临床症状的严重程度，可被分为轻、中、重型GSSD[1]。重型GSSD患儿因其粒细胞功能缺陷，容易发生反复细菌感染[8]。GSSD患者可出现眼部病变，如晶状体混浊、色素性视网膜炎及黄斑水肿等[14,15]。Tokatli等[16]报道1例GSSD患者，因服用对乙酰氨基酚诱发严重代谢性酸中毒及代谢性脑病，因此GSSD患者应尽量避免服用对乙酰氨基酚。
本例患儿生后1 d起病，伴中度贫血、重度代谢性酸中毒，尿有机酸分析提示焦谷氨酸尿症，并且存在中枢神经系统影像学异常，故符合重型GSSD诊断标准，经基因检测发现GSS基因致病性突变而确诊该病。由于基因检测耗时长，常不能依赖基因检测手段对该病患儿起病初期、病情严重阶段进行诊断，因此临床证据对诊断该病非常关键。对疑似该病患儿，首诊医师应针对患儿的"贫血"症状完善相关检查，若能发现患儿为溶血性贫血，再结合代谢性酸中毒及焦谷氨酸尿症，则对疾病临床诊断具有重大提示意义，由此亦可提高该病的临床诊断率。由此可见，既往由于临床医师对遗传代谢性疾病缺乏足够认识，以及检测条件限制，中国可能有很多GSSD患儿被漏诊。
随着串联质谱、气相色谱-质谱及基因检测技术普及，中国自2017年以来，已有4例GSSD患儿被诊断，并被文献报道，包括本例患儿。Njålsson等[17]对GSSD患者的基因突变类型与临床表型的关系进行分析的结果显示，中、重型GSSD患者仅有基因移码突变或无义突变，提示在一定程度上GSS基因突变类型，可预测患者临床表型。文献报道的6例临床表型为中或重型GSSD患儿及本例患儿(重型)，均可在GSS基因第5外显子检出c.491G>A纯合突变或复合杂合突变[3,5,6,10]，并且为最常见的GSS基因突变位点，提示检出该位点突变，可能为中或重型GSSD患儿的诊断提供参考。
早期诊断及治疗，是GSSD患儿生存、改善预后的最重要因素[8]。Njålsson等[17]研究结果显示，中型GSSD患儿若未得到及时诊治，随着时间推移可能逐渐出现神经系统疾病症状，提示除基因突变因素外，环境等外界干预因素，可能使其临床表型加重。Atwal等[8]对1例生后确诊GSSD患儿进行19年随访的结果显示，尽管患儿在生长发育中逐渐出现语言与注意力障碍、癫痫等神经系统症状，但在积极采取药物治疗及康复训练后，患儿精神、运动发育功能均可恢复正常，提示早期诊断及早期、终身治疗，有助于改善GSSD患儿预后。因此，临床医师应加强对GSSD的认识，对可疑病例早期进行血串联质谱和尿气相质谱有机酸分析，根据尿有机酸分析结果显示大量焦谷氨酸，可作出GSSD临床诊断，并通过GSS基因检测确诊该病，实现早诊断、早治疗，从而改善患儿预后。
GSSD患儿需要终身治疗，主要为纠正酸中毒及防止抗氧化损伤，包括静脉或口服碳酸氢钠、大剂量维生素C、E，以及避免应用氧化性药物，如苯巴比妥、阿司匹林、磺胺类等[9,11]。在选择口服碳酸氢钠药物时，肠溶型较胃溶型具有更高生物利用度，可避免过多摄入Na+及减轻胃胀气等不适[7]。Atwal等[8]文献报道首例接受硒治疗的GSSD患者，由于硒可通过形成硒蛋白而具有强抗氧化功能，从而避免细胞遭受自由基损伤，达到改善GSSD患儿预后的目的。
GSSD由GSS基因突变导致，表现为溶血性贫血、代谢性酸中毒、焦谷氨酸尿症及神经系统病变等。在一定程度上，GSS基因突变类型可能预测患儿临床表型，c.491G>A为其常见基因突变，发生该突变患儿临床表型为中或重型。对该病患儿早期诊断及治疗能提高其生存率、改善长期预后。
所有作者均声明不存在利益冲突
