液体活检(LB)是一种利用人体体液获取疾病诊治相关信息的技术，已在多个领域，尤其是肿瘤诊治领域广泛开展，并取得突破性进展。LB在新生儿脑损伤，如颅内出血、新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)及早产儿脑白质损伤等诊断中的应用已有开展。笔者拟就LB在新生儿脑损伤诊断及预后判断中的优势、应用现状等最新研究进展进行阐述，旨在为临床对新生儿脑损伤的诊断及预后判断提供参考。
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液体活检(liquid biopsy，LB)是利用人体体液获取疾病诊治相关信息的技术。1974年，Sorrells[1]最早提出LB的概念，即通过对人体关节腔积液成分分析诊断滑膜病变。广义LB的检测样本来源于血液、浆膜腔积液、脑脊液、尿液等人体体液中的蛋白质或多肽、细胞、核酸、外泌体等，进行疾病诊断及预后判断。狭义LB，则是指通过使用人体体液中的特定病理材料，主要包括外周血循环外泌体、细胞和核酸等，进行疾病早期筛查、治疗方案制定、治疗效果监测和疾病复发监控等[2]。发生新生儿脑损伤时，血、脑脊液屏障被破坏，来源于大脑的外泌体、细胞和核酸，可以进入外周血液循环和其他体液，通过检测这些物质达到诊断新生儿脑损伤目的的方法，被称为"液体脑活检"[3]。本文所指的新生儿脑损伤，包括新生儿颅内出血，缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)及早产儿脑白质损伤等。既往临床对新生儿脑损伤的诊断，多依赖于临床症状及影像学检查结果[4]。对新生儿脑损伤的临床症状判断具有主观性、经验性，而影像学检查结果，具有滞后性和不可及性等，均不利于对该病的早期诊断[5]。随着LB技术的发展，在新生儿脑损伤诊断中的应用已有开展，有望促进新生儿脑损伤的早期诊断和预后判断，而且越来越多研究结果表明，LB在判断新生儿脑损伤严重程度和预后判断中具有很好的应用前景[6,7]。笔者拟就LB用于新生儿脑损伤诊断与预后判断中的优势及应用现状等最新研究进展进行阐述，旨在为临床对新生儿脑损伤诊断及预后判断提供参考。
根据澳大利亚昆士兰临床指南《缺氧缺血性脑病介绍(2018)》，在出生时有窘迫史或生后数小时出现意识障碍或惊厥、难以启动或维持自主呼吸、肌张力低下和反射抑制等神经功能障碍表现的新生儿，应被疑诊为新生儿脑损伤患儿[8,9]。这些临床判断在很大程度上依赖于临床医师的经验，对被疑诊为新生儿脑损伤的患儿，是否开展治疗或启动治疗的时机，迄今均存在一定主观性，尚不统一[8,9]。随着影像学技术的发展，头颅超声、CT、MRI检查广泛用于对新生儿脑损伤的辅助诊断，尽管床旁头颅超声，可对新生儿进行连续性监测，但是影像学方法多是通过显示已经发生解剖学变化图像进行疾病判断，而对辅助诊断疾病早期已经发生的病理变化不敏感，可能延误诊断或出现假阴性结果，从而导致患儿错失最佳治疗时机[10]。由于影响临床判断效果的因素多，以及影像学检查在新生儿脑损伤早期诊断不敏感，从而导致临床难以及时对该病患儿采取治疗措施，进而可能严重影响患儿预后及转归，如新生儿脑损伤患儿亚低温治疗的最适宜治疗时间窗为发病6 h内。因此，早期识别新生儿脑损伤的发生及评估脑损伤严重程度，对该病患儿治疗疗效影响较大。
LB为新生儿脑损伤诊断及预后判断带来新思路。通过检测新生儿外周血中游离生物标志物、循环外泌体、循环细胞和循环核酸等，可早期、准确诊断新生儿脑损伤[11]。新生儿发生脑损伤后，早期脑组织来源的生物标志物，可帮助临床迅速、准确识别新生儿脑损伤[5]。某些来源于新生儿大脑的外泌体成分，如突触足蛋白等，在新生儿脑损伤发生后，在外周血液循环中含量变化快，可动态反映脑损伤程度，类似于心肌梗死中的"肌钙蛋白"作用，是新生儿脑损伤患儿诊断与疗效预测的良好指标[11]。
大脑不同于其他器官，于大脑取材进行传统组织病理学活检，达到对疾病准确诊断的目的，在临床应用中非常困难。对外周血液中来源于新生儿大脑的循环外泌体检测，是采取LB手段诊断新生儿脑损伤的主要策略[12]。外周血液中来源于新生儿大脑的循环外泌体含有脑细胞内成分(蛋白质、核酸、代谢产物)，膜蛋白、脂质及与之结合的细胞外蛋白质，而被认为是起源于脑细胞的，可诊断新生儿脑损伤的微型替代物，即在人体体液中检出来源于新生儿大脑的组织特异性外泌体及其内容物，从而实现对新生儿脑损伤的临床诊断[13]。对于采取LB进行新生儿神经系统疾病诊断，取材多来自于外周血和脑脊液，常通过对这些体液进行超速离心和密度梯度离心获得LB样本[12,14]。外周血作为LB常用临床诊断标本，而外泌体在血浆中，可维持大部分蛋白质和核酸含量恒定，因此新鲜血浆是完整外泌体的最佳来源[15]。
在采取外周血循环外泌体作为LB检测样本进行多种神经系统疾病诊断的研究中，主要对创伤性脑损伤、神经系统退行性病变患儿进行诊断[12,16]。创伤、缺氧缺血、神经系统退行性病变等导致的新生儿脑损伤，其共同特征为合并缺氧因素[3,12]。缺氧引起兴奋性毒性级联反应和自由基损伤，可导致患儿炎症级联反应，对神经元和胶质细胞产生损伤，发生兴奋性氨基酸及脂质过氧化产物与微小RNA(microRNA，miRNA)等改变。这些导致新生儿脑损伤发生的物质，可通过受损血、脑脊液屏障或由外泌体携带进入外周血液。外周血液中的许多蛋白质成分，可作为LB诊断新生儿脑损伤的血液标志物，外周血液中这些蛋白质浓度，不仅对该病具有重要诊断潜力，而且外周血液循环外泌体中的这些相同蛋白质，更能反映新生儿脑损伤发生机制[17]。由此可见，来源于机体受损大脑的外泌体，可与外周血液循环细胞重要生物学功能相关联，若对与炎症反应相关细胞信号通路及大脑内错误折叠蛋白质清除关联[16,18]的外泌体成分进行LB，可追溯脑损伤病理机制。机体受损大脑的外泌体，可以穿过血、脑脊液屏障至外周血液循环，并且这一过程中，外泌体内的蛋白质和核酸成分不被降解[11,12]，这为采取外泌体内容物进行LB，从而达到诊断机体脑损伤提供可能。来源于新生儿大脑的外泌体中携带的表面跨膜蛋白质，还代表其细胞起源，并可被准确鉴别诊断，因而通过对外周血液循环外泌体进行LB，可实现对新生儿脑损伤细胞的准确定位[16,18]。由此可见，对外周血液循环外泌体样本进行LB，对于无创诊断机体神经系统疾病，尤其是新生儿脑损伤具有重要意义。外泌体生物标志物与神经系统疾病诊断的关系，见表1。虽然这些外泌体生物标志物，目前尚未直接用于新生儿脑损伤诊断，但是对于新生儿脑损伤诊断指标的确定，具有参考价值。目前临床用于新生儿脑损伤诊断中，主要涉及的相关游离血液生物标志物，见表2。
外泌体生物标志物与神经系统疾病诊断的关系
目前临床用于新生儿脑损伤诊断中，主要涉及的相关游离血液生物标志物
胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，是星形胶质细胞独有的Ⅲ型中间丝状蛋白，主要作用是构成细胞骨架[27]。星形胶质细胞足突是构成血、脑脊液屏障的一部分，并且在机体发生脑损伤后被破坏，脑损伤早期即可导致GFAP被释放入外周血液。正常情况下，GFAP主要表达于中枢神经系统的星形胶质细胞，但是在软骨细胞、成纤维细胞、肌上皮细胞、淋巴细胞、肝星形细胞等非神经系统细胞中也有表达[27]。外周血液中GFAP水平增高程度，与新生儿脑损伤程度密切相关，是脑室周围白质软化、脑室周围-脑室内出血、新生儿HIBD等新生儿脑损伤疾病较好的早期诊断指标[28,29]。在早产儿发生脑损伤时，外周血清GFAP水平增高，并且该变化的发生早于颅脑影像学变化，发生脑损伤6 h内，早产儿外周血清GFAP水平增高即可被检出[32,33,34]。GFAP作为新生儿脑损伤LB生物标志物的显著优势包括，整个脑损伤过程中，在新生儿外周血清中均可被检出GFAP水平增高。Ennen等[35]使用一种更敏感的检测方法，对新生儿重症监护病房患儿GFAP水平进行检测发现，GFAP是HIBD较为特异的生物标志物，可有效区分HIBD和其他器官衰竭的患儿，并且GFAP只表达于中枢神经系统中的星形胶质细胞，因此GFAP是诊断脑组织病变的特异性生物标志物。目前已经证实，外周血清GFAP水平增高，与新生儿神经行为评分、头颅MRI检查结果异常具有良好相关性[35,36]，由此证明外周血清GFAP水平增高，在新生儿脑损伤诊断中具有及时、准确的特点。Kodidela等[19]研究结果显示，在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染或烟、酒所致神经功能障碍患者外周血中，可检测到外泌体GFAP水平显著增高。运动相关急性期脑震荡患者外周血中，也可检测到外泌体GFAP水平改变[20]。Mondello等[21]研究结果显示，患者发生中至重度创伤性脑损伤5 d内，来源于机体受损大脑外泌体的GFAP水平与机体游离GFAP水平具有相关性，其研究还发现，弥漫性脑损伤患者外泌体GFAP水平，较局灶性脑损伤患者更高。这为针对外周血液循环外泌体GFAP水平变化采取LB检测，进行新生儿脑损伤诊断提供思路与借鉴，但是相关研究还需要进一步开展。
在早产儿脑损伤后，GFAP不但可作为LB诊断指标，其浓度的动态变化还可预测患儿2岁以内的运动发育结果[32]。此外，GFAP还可用于亚低温治疗HIBD患儿疗效的动态监测。亚低温治疗不会改变新生儿脑损伤后血清GFAP水平，因此血清GFAP水平可直接反映新生儿脑损伤程度，可作为亚低温治疗HIBD疗效与预后评估的重要指标[35]。
髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)是少突胶质细胞的特异性标志蛋白，作为髓鞘的主要成分，主要功能是维持髓鞘结构及功能稳定，MBP是评估脑白质髓鞘损伤的重要生化指标[37]。新生儿外周血MBP水平增高，可诊断或预测其脑白质损伤及神经纤维脱髓鞘病变，如脑室周围白质软化、脑室周围-脑室内出血、新生儿HIBD等[5,38]，并且可以通过外周血MBP水平预测新生儿脑损伤严重程度，从而判断患儿预后[38]。一项关于婴幼儿脑外伤的研究结果显示，外周血MBP水平，还可以作为监测其创伤后神经功能恢复的指标[30]。Galazka等[22]对多发性硬化症患者外周血液循环外泌体中多种髓鞘蛋白水平检测的结果显示，外泌体MBP水平增高最为显著，这对多发性硬化症的诊断具有临床价值。Kawata等[20]研究结果显示，运动相关脑震荡患者外周血液循环外泌体MBP水平增高显著。由此可见，可基于外周血液循环外泌体MBP水平变化，对婴幼儿脑损伤、多发性硬化症、运动相关脑震荡患者，采取LB手段进行诊断。但是，对外周血液循环外泌体MBP采取LB，在新生儿脑损伤诊断和预后判断中的应用亟待进一步开展。
突触足蛋白是神经元中树突棘形成所必需的细胞骨架蛋白，并且是突触可塑性的关键介质，尤其是在兴奋性突触中[11]。Goetzl等[11]对14例进行亚低温治疗HIBD新生儿，通过采集其发生HIBD后，第8、10和14小时的血液样本，进行外泌体突触足蛋白定量分析，以住院时间、抗惊厥药物治疗及复合神经影像学评分作为其治疗结局指标的研究结果发现，头颅影像学检查结果异常的该病患儿，均合并外周血液循环外泌体突触足蛋白水平下降，因此外泌体突触足蛋白水平，可采取LB进行检测，作为预测新生儿急性脑损伤的生物标志物，较神经元特异性烯醇化酶、miRNA更为可靠[11]。该项研究还表明，神经来源的外泌体水平，在外周血液循环中变化快，可作为新生儿急性脑损伤预后判断指标[11]。在一项孕母酒精暴露后胎儿中枢神经系统损伤评估的研究中，大量酒精暴露后，孕妇外周血中可检出外泌体突触足蛋白水平明显下降。由此可见，针对外周血液循环外泌体突触足蛋白水平变化进行LB检测，有望成为新生儿中枢神经系统损伤的无创检测指标[39]。
中枢神经系统中存在很多miRNA，不同种类miRNA作用不同，主要参与机体神经系统的生长、发育、修复等多种生理及病理过程。一些对miRNA的研究已证明，miRNA可以作为预测新生儿脑损伤的生物标志物[31]。miRNA在LB中，既可以作为循环核酸，也可以作为外泌体携带物质[12]。Jeyaseelan等[31]研究发现，114个miRNA在新生儿缺血性脑损伤后，在外周血液中表达异常，在缺血再灌注24 h时，miR-210、-215、-324-3p、-422b、-451、-497和脑特异性miR-134可上调至正常值的2倍。Ma等[40]对生后10 d缺氧缺血新生大鼠病理模型的研究发现，缺氧缺血2.5 h后，其miR-210较正常值显著上调，而miR-124在除脑垂体以外的所有脑区，均特异性高表达，脑卒中24 h后，发生脑血管短暂性和永久性闭塞时，外周血血浆中miR-124表达也较正常值显著增加[41,42]，并且miR-124被证明是新生鼠中枢神经系统疾病的诊断和预后判断指标[43]。不仅如此，miR-124在出血性脑损伤新生鼠外周血血浆中的增高程度，显著高于缺血性脑损伤新生鼠，因此可采用miR-124检测鉴别诊断新生鼠的出血性脑损伤和缺血性脑损伤。但是，miR-124是否可用于新生儿中枢神经系统疾病的诊断和预后判断，则尚需进一步研究、证实。Kumar等[23]针对创伤性脑损伤成年雄性鼠模型的研究发现，其外周血血浆中来源于小胶质细胞的外泌体miR-155水平明显增高。由于miRNA半衰期短，除脑组织特异性miRNA外，外周血中可被检测到的miRNA并不能明确是否为脑组织来源，因而采取LB检测外周血血浆中外泌体携带miRNA水平变化，对新生儿脑损伤诊断的临床价值尚需进一步研究、证实。
理论而言，外周血来源于脑组织的各种循环细胞，均可用于新生儿脑损伤诊断，但是目前只有来源于脑微血管内皮细胞，被用于新生儿脑损伤诊断的相关文献报道[44,45,46,47]。脑微血管内皮细胞作为血、脑脊液屏障的主要构成部分，在新生儿脑损伤发生后，外周血脑血管内皮细胞水平增高，由此使其具有LB的诊断潜力[44]。Huang等[44]研究发现，采取去氧麻黄碱、尼古丁及HIV的病毒膜蛋白gp120作用的小鼠外周血中，CD146+(内皮细胞标记)/S100B+(脑细胞标记)的循环脑微血管内皮细胞和CD133+(祖细胞标记)/CD146+标记的循环内皮祖细胞水平增高。在一项以艾滋病患者为对象的研究中证明，外周血液循环中的脑微血管内皮细胞，可以作为血、脑脊液屏障损伤生物标志物，并且已经成功建立LB检测方法，外周血循环细胞水平与血脑屏障损伤和炎症反应程度呈正相关[45]。这对采用LB方法检测外周血循环脑微血管内皮细胞，诊断新生儿脑损伤具有重要参考价值。在一项针对放射性脑损伤患儿的研究中也证明，患儿外周血循环内皮细胞水平与其脑损伤严重程度密切相关[46]。在严重新生儿脑室周围出血和围生期窒息导致癫痫发作新生儿，监测其外周血中脑源性循环内皮细胞水平，可作为脑血管损伤诊断和预后判断生物标志物[47]。由此可见，采取LB检测外周血来源于脑组织的循环细胞，对于新生儿脑损伤的诊断及预后判断值得期待。
外周血循环核酸包括RNA及DNA，循环RNA以miRNA为主，已由前述，以下主要针对外周血循环DNA作为LB检测新生儿脑损伤标志物进行阐述。2003年，Rainer等[48]首次将细胞游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)作为脑卒中诊断生物标志物。cfDNA在评估创伤性脑损伤患者预后中，也有极大效用，在脑卒中死亡患者中，cfDNA水平明显高于出院时存活者，并且cfDNA水平与脑血肿体积及脑损伤严重程度相关，可以预测脑卒中患者死亡率及其预后[48,49]。Lehmann-Werman等[50]研究进一步明确cfDNA特异性，其通过从供体血浆或血清中分离cfDNA，并对其进行测序，从而量化带有目标细胞类型甲基化标记cfDNA。该项研究发现，在复发性多发性硬化症患者中，可鉴定出少突胶质细胞DNA，并且在颅脑外伤或心脏骤停患者中，可鉴定出神经元/神经胶质源性DNA[50]。由此可见，对外周血液循环中组织特异性cfDNA检测，为采取LB进行新生儿脑损伤诊断及其预后判断，提供充分可行性。
综上所述，LB具有采样方便，可动态监测，并早期诊断新生儿脑损伤疾病的优点。目前越来越多研究结果表明，外周血液循环中的多种生物标志物可早期诊断新生儿脑损伤，并且与新生儿头颅MRI检查结果具有很好的一致性，虽然目前尚缺乏LB对这些生物标志物在新生儿脑损伤疾病发生、发展不同阶段研究，但是为采取LB进行新生儿脑损伤诊断及预后判断提供了充分可能性。新生儿脑损伤疾病临床诊断及预后判断，尚需寻找敏感度和特异度更高、适宜进行LB检测的生物标志物；同时尚需开发更多经济、可行的新生儿脑损伤疾病LB检测方法。对新生儿外周血特定生物标志物的LB检测，在新生儿脑损伤的早期诊断与预后判断中的应用具有广阔前景。
所有作者均声明不存在利益冲突
