探讨无创产前检测(NIPT)筛查胎儿染色体拷贝数变异(CNV)(主要为染色体微缺失/微重复)的临床价值。
选择2019年1月至2021年10月，于山西医科大学第一医院接受NIPT，结果提示胎儿染色体缺失或重复，并接受介入性产前诊断的67例孕妇为研究对象。回顾性分析其临床病例资料。对孕妇羊水细胞进行胎儿染色体核型分析及染色体微阵列分析(CMA)，并分析NIPT发现的胎儿染色体CNV与上述介入性产前诊断结果的一致性。本研究遵循的程序符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。所有孕妇对其上述检测均知情同意，并签署临床研究知情同意书。
①于上述选择的时间段内，接受NIPT筛查的29 479例孕妇中，胎儿染色体缺失或重复为87例，筛查结果胎儿染色体CNV发生率为0.30%(87/29 479)。②介入性产前诊断的67例孕妇中，确诊胎儿染色体CNV为35例，NIPT筛查胎儿染色体CNV的阳性预测值为52.2%(35/67)；29例胎儿的CMA与NIPT筛查结果显示的胎儿染色体CNV基本一致，二者检测胎儿染色体CNV符合率为43.2%(29/67)。
NIPT筛查胎儿染色体CNV具有可行性。对于NIPT筛查结果为胎儿染色体CNV者，应采取产前诊断方法进一步确诊。
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染色体拷贝数变异(copy number variation, CNV)包括染色体数目异常(21、18、13-三体等)和染色体微缺失、微重复等。无创产前检测(noninvasive prenatal testing，NIPT)技术，是目前胎儿常见染色体非整倍体筛查的高精准方法，并且对于筛查胎儿21-、18-、13-三体综合征的准确性，已在临床应用中被广泛认可。随着高通量测序技术发展，对DNA的测序深度和广度更精准，使得NIPT技术在筛查胎儿是否罹患21-、18-、13-三体综合征的同时，还可发现胎儿染色体微缺失/微重复[1]。
染色体致病性CNV(pathogenic copy number variations, pCNV)是导致个体先天畸形、智力障碍等出生缺陷的重要遗传因素之一。胎儿pCNV携带率可高达1.6%~1.7%，远高于21-、18-、13-三体约0.2%的携带率[2]。文献报道，胎儿常染色体和性染色体CNV在胎儿染色体CNV中的占比分别为0.40%和0.22%，常见的胎儿染色体CNV包括染色体非整倍体、染色体微缺失/微重复等[3]。人类染色体微缺失/微重复多而复杂，具体致病机制目前尚不清楚，其在胎儿中发生可能与孕妇年龄无关，并且多数该病患儿为染色体核型正常夫妇所生育，目前对胎儿染色体微缺失/微重复尚无相关的产前筛查及产前诊断规范或指南[4]。NIPT技术在对胎儿21-、18-、13-三体进行筛查时，可同时发现胎儿染色体CNV，但是是否可将NIPT技术扩展到对胎儿染色体CNV的筛查，尤其对胎儿染色体缺失和(或)重复片段≥5 Mb的染色体CNV患儿中，以及NIPT技术对该异常筛查的准确性，成为目前生殖医学领域的研究热点与难点[5]。笔者拟对NIPT结果提示可能存在胎儿染色体CNV的孕妇，同时抽取羊水进行胎儿染色体核型分析及染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)的临床病例资料，进行回顾性分析，旨在探讨NIPT技术对胎儿染色体CNV筛查的临床价值。现将研究结果报道如下。
选择2019年1月至2021年10月，于山西医科大学第一医院接受NIPT结果提示胎儿染色体缺失或重复，并同时接受介入性产前诊断的67例孕妇为研究对象。本研究遵循的程序符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。所有孕妇对其进行羊水细胞培养、胎儿染色体核型分析及CMA等均知情同意，并签署临床研究知情同意书。
本研究孕妇纳入标准如下[6]。①孕龄为15~22+6孕周的单胎妊娠孕妇；②NIPT筛查结果提示胎儿染色体缺失或重复异常者；③同时接受介入性产前诊断者。排除标准：①NIPT筛查结果为胎儿染色体21-、18-、13-三体综合征者；②夫妻双方合并染色体异常疾病者；③合并感染性疾病、凝血功能障碍疾病者；④先兆流产者；⑤胎盘前置伴出血者；⑥羊水过少者。
于孕妇15~22+6孕周时，采集其外周(肘静脉)血10 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，于4 ℃条件下，以455 g离心10 min，取上清液待检。由本研究组成员，采用核酸提取试剂盒(批号为1006201912018、1006202013019、1006202013020等，深圳华大基因股份有限公司)，提取胎儿血浆游离DNA，测定基因组DNA浓度，然后将DNA置于-20 ℃冰箱保存。根据胎儿染色体非整倍体T21、T18、T13检测试剂盒(批号分别为30032019111012、30032020111009、30003202111014等，深圳华大基因股份有限公司)说明书，进行文库构建、质量控制和汇集。使用BGISEQ-500型高通量测序仪(深圳华大基因股份有限公司)，进行胎儿DNA测序；应用生物信息学算法，与人类参考基因组(hg19)(http：//hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/chromFa.tar.gz)进行比对，从而对测序结果进行分析。
对于接受介入性产前诊断的67例孕妇，在其孕龄为18~25孕周时，进行羊水穿刺术产前诊断。由具有产前诊断资质、经验丰富的产科医师，在超声引导下进行操作，分别抽取这67例孕妇羊水30 mL，其中20 mL分别置于2个离心管中(每管10 mL)，于4 ℃条件下，以455 g离心10 min，留取离心后沉淀(含胎儿脱落上皮细胞)进行羊水细胞培养，用于胎儿染色体核型分析；其余10 mL羊水，留作胎儿CMA备用。
由本院优生遗传科具有产前诊断资质的技术人员，将20 mL羊水离心后沉淀的羊水细胞，按照产前诊断的双线培养规范要求，分别接种于2个装有4.5 mL含血清的培养瓶中，并按照羊水细胞染色体制备常规方法进行细胞培养7~12 d，然后收集培养的羊水细胞进行胎儿染色体制片、G显带核型分析[7]。采用染色体图像分析系统LEICA GSL-120全自动染色体扫描仪(德国莱卡公司)，获得胎儿染色体中期分裂象。严格参照2016版《国际人类细胞遗传学命名系统(ISCN)》，对胎儿染色体核型进行分析、命名[8]。
由本科室基因检验实验室专业人员，将收集的10 mL备用羊水置于无菌离心管中，于4 ℃条件下，以455 g离心10 min，留取上清液。对上清液采用Cyto scan 750K Array微阵列芯片(美国Affymetrix公司)，严格按照基因组DNA提取试剂盒(Qiangen试剂盒K281-50，批号为1002020190808、1002020200301、1002020201208等，德国凯杰生物基因公司)标准操作流程进行CMA。对胎儿CMA结果使用Chas软件读取数据，将芯片结果比对实验室本地数据库及DECIPHER(https：//decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(http：//www.omim.org/)、ClinGen(https：//clinicalgenome.org/)、ClinVar(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)等公共数据库，对胎儿染色体CNV进行分类评估[9]。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics)指南[10]，将胎儿染色体CNV分为染色体pCNV、可能致病性CNV、良性CNV、可能良性CNV及临床意义不明确CNV 5类。
2019年1月至2021年10月，本院29 479例接受NIPT技术筛查的孕妇中，结果提示胎儿染色体缺失或重复者为87例，筛查结果胎儿染色体CNV发生率为0.30%(87/29 479)。其中，同意接受介入性产前诊断的67例孕妇(77.01%，67/87)中，NIPT筛查结果为胎儿染色体CNV的DNA片段(长度)<5 Mb者为25例(37.31%)，5 Mb≤DNA片段<10 Mb者为9例(13.43%)，DNA片段≥10 Mb者为15例(22.39%)，另有18例(26.87%)仅提示胎儿存在某条染色体信号异常，但未能明确缺失或重复DNA片段的长度及位置。
67例接受介入性产前诊断的孕妇中：确诊胎儿染色体CNV为35例，NIPT筛查胎儿染色体CNV的阳性预测值为52.2%(35/67)；染色体核型分析检测到2例为染色体平衡易位，CMA未能检出其染色体异常；其余30例孕妇的羊水细胞染色体核型分析及CMA检测，均未发现胎儿染色体异常。35例产前诊断确诊胎儿染色体CNV孕妇中，29例CMA检测到的胎儿染色体CNV与NIPT筛查提示存在的染色体异常基本相符，故本研究的NIPT技术与CMA对胎儿染色体CNV的检测符合率为43.2%(29/67)。
67例孕妇的介入性产前诊断结果如下。①胎儿染色体核型分析结果：核型正常为54例；异常为13例(除2例为染色体平衡易位外，11例核型异常结果与NIPT提示的胎儿染色体CNV基本相符，并且异常DNA片段均>5 Mb)。②CMA结果：对于以下数据，若同1例胎儿既有染色体缺失又有重复时，分别计数发生缺失或重复的DNA片段个数；若同1例胎儿有多个DNA片段缺失或重复，计入缺失或重复片段大的一组数据里。CMA结果显示胎儿染色体CNV为35例，其DNA片段大小为115.7 kb至31.2 Mb，包括微缺失DNA片段16个、微重复13个，4例胎儿DNA片段既有缺失，也有重复(病例No.8、12、16、31)，见表1。这35例胎儿染色体CNV中，DNA片段<5 Mb为22个(10个缺失、12个重复)，5 Mb≤DNA片段<10 Mb为5个(3个缺失、2个重复)，DNA片段≥10 Mb为10个(7个缺失、3个重复)；35例胎儿染色体CNV包括26例pCNV、7例临床意义不明确CNV及2例良性CNV。35例确诊为染色体CNV胎儿的NIPT及产前诊断结果比较，见表1。
35例确诊为染色体CNV胎儿的NIPT及产前诊断结果比较
35例确诊为染色体CNV胎儿的NIPT及产前诊断结果比较
| 病例(No.) | NIPT结果 | 染色体核型分析结果 | CMA结果 | CNV分类 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | del(1q)，4.8 Mb | 46，XN | del(1)(q43)，3.4 Mb | pCNV |
| 2 | del(1p)，3.08 Mb | 46，XN | del(1)(p36.33 p36.32)，1.9 Mb | pCNV |
| 3 | 20号染色体偏多 | 46，XN | del(1)(q21.3)，117.4 kb | 良性CNV |
| 4 | dup(2q), 12.3 Mb | 46，XN，add(2)(q34) | dup(2)(q34 q37.3)，33.4 Mb | 均为pCNV |
| dup(14)(q11.2q12)，5.4 Mb | ||||
| 5 | del(2q12.12)，1.49 Mb | 46，XN | del(2)(q21.1)，320.1 kb | 临床意义不明确CNV |
| 6 | dup(4q)，5.5 Mb | 46，XN | dup(3)(q21.2)，786.5 kb | 均为pCNV |
| dup(4)(q12)，3.9 Mb | ||||
| 7 | 3号染色体部分缺失 | 46，XN | del(3)(q25.32 q26.31)，14.8 Mb杂合性缺失 | 均为临床意义不明确CNV |
| 8 | del(4q), 9.96 Mb | 46，XN，del(4)(q35) | del(4)(q34.3q35.2)，11.7 Mb | 均为pCNV |
| dup(3)(p26.3p26.)，3.8 Mb | ||||
| 9 | dup(5q)，1.02 Mb | 46，XN | dup(5)(q11.2)，809.0 kb | pCNV |
| 10 | dup(14q)，5.75 Mb | 46，XN | dup(14)(q24.3q31.1)，1.3 Mb 2次重复 | 均为pCNV |
| 11 | 22号染色体偏多 | 46，XN | dup(7)(p12.1p11.2)，4.3 Mb | pCNV |
| 12 | dup(7q)，4.91 Mb | 46，XN | dup(7)(q36.3)，2.1 Mb | pCNV |
| del(9)(p24.2)，115.7 kb | 良性CNV | |||
| 13 | del(X)(q21.1-q28)，25.29Mb | 46，XN | dup(8)(p21.2)，1.2 Mb | 良性CNV |
| 14 | dup(8p)，5.38 Mb | 46，XN | dup(8)(p23.2p23.1)，2.6 Mb | 临床意义不明确CNV |
| 15 | del(9p)，15.05 Mb | 46，XN，del(9)(p24) | del(9)(p24.3p23)，13.6 Mb | pCNV |
| 16 | 10号染色体异常 | 46，XN，dup(10)(q26) | dup(10)(p15.3p12.1)，25.9 Mb | 均为pCNV |
| dup(10)(q26.13q26.2)，2.5 Mb | ||||
| del(10)(q26.2q26.3)，6.3 Mb | ||||
| 17 | del(12p)，1.5 Mb | 46，XN | del(12)(p11.23)510.1 kb | pCNV |
| 18 | del(12q)，6.8 Mb | 46，XN | del(12)(q24.32q24.33)，4.2 Mb | pCNV |
| 19 | del(1p)，32.99 Mb | 46，XN | dup(12)(q24.21)，250.1 kb | 临床意义不明确CNV |
| 20 | del(13q)，18.51 Mb | 46，XN，del(13)(q14) | del(2)(q21.1)，320.1 kb | 均为pCNV |
| del(13)(q21.2q21.33)，11.6 Mb | ||||
| del(13)(q21.33q31.1)，8.9 Mb | ||||
| del(20)(p12.3p12.2)，1.3 Mb | ||||
| 21 | del(14q)，8.76 Mb | 46，XN | del(14)(q13.3q21.2)，7.7 Mb | pCNV |
| 22 | del(14q) ，21.5 Mb | 46，XN，del(14)(q32) | del(14)(q32.11q32.33)，17.2 Mb杂合性缺失 | 均为pCNV |
| 23 | 性染色体偏多 | 45，X(12)/46，XN(88) | 疑似有低比例45，X/46，XX，或XXX/X/XX，或XXX/X等性染色体嵌合del(15)(q15.2)，329.0 kb | 均为pCNV |
| 24 | del(15)(q11.2-q13.1)，5.43 Mb | 46，XN | del(15)(q11.2q13.1)，6.2 Mb | pCNV |
| 25 | 11号染色体偏多 | 46，XN | dup(16)(p13.11)，1.6 Mb | pCNV |
| 26 | 22号染色体偏多 | 46，XN | del(16)(p11.2)，946.9 kb | 临床意义不明确CNV |
| 27 | 15号染色体偏多 | 47，XN，+15(8)/ 46，XN(62) | 胎儿疑似为低比例15号染色体三体嵌合体 | 临床意义不明确CNV |
| 28 | dup(17q)，3.5 Mb | 46，XN | dup(17)(q12)，1.8 Mb | pCNV |
| 29 | dup(18p)，25.8 Mb | 46，XY，der(18)t(18；21)？ | dup(18)(p11.32q12.1)，31.2 Mb | pCNV |
| 30 | 18-三体高风险 | 46，XN，+add(18)？ | dup(18)(q11.1q12.1)，9.5 Mb | 临床意义不明确CNV |
| 31 | del(18q22.2-q23)，10.33 Mb | 46，XN，18？ | dup(18)(p11.32p11.22)，9.6 Mb | 均为pCNV |
| del(18)(q22.2q23)，11.1 Mb | ||||
| 32 | del(15q)，5.14 Mb | 46，XN | del(15)(q21.3q22.2)，4.8 Mb | pCNV |
| 33 | del(21q)，9.05 Mb | 46，XN | del(21)(q22.12q22.3)，11.3 Mb杂合性缺失 | 均为pCNV |
| 34 | 20号染色体偏多 | 47，XN，+20(58)/ 46，XN(12) | 2条20号染色体分别来自父母一方的单亲二体性 | pCNV |
| 35 | dup(22q)，5.61 Mb | 46，XN | dup(22)(q11.21q11.23)，3.5 Mb | pCNV |
注：病例No.3，11、13、19、25、26 NIPT提示的异常与CMA检测到的CNV类型不相符。NIPT为无创产前检测，CMA为染色体微阵列分析，CNV为拷贝数变异，pCNV为致病性拷贝数变异
当CNV发生在染色体上罕见或新生位置，变异片段相对大，含有临床相关致病基因和已确定的综合征时，称为pCNV。pCNV出现在特定染色体上，并且含有重要基因区域，就可能引起染色体微缺失/微重复综合征，可导致患儿严重智力低下、发育迟缓、生长发育异常等[13]。
本研究结果显示，采取NIPT技术筛查胎儿染色体CNV的阳性预测值为52.2%(35/67)，假阳性率为47.8%，这与卢建等[14]报道的NIPT筛查18-三体和13-三体的假阳性率51.1%和51.9%相近。这提示，NIPT用于筛查胎儿染色体CNV具有与筛查18-、13-三体相似的临床价值。考虑NIPT结果出现假阳性的原因可能如下。①母体DNA的干扰：孕妇血浆DNA不仅包含胎儿DNA，更有大量母体DNA，当母亲存在染色体异常时，会干扰对胎儿DNA的分析；②限制性胎盘嵌合：这是指胎盘(绒毛膜)染色体核型异常，而胎儿染色体核型正常的嵌合现象。羊水细胞中胎儿游离DNA来源于胎盘滋养层细胞，如果胎儿存在限制性胎盘嵌合体，则NIPT筛查结果会提示胎儿染色体异常；③对胎儿DNA测序数据量不足，存在生物信息分析方法缺陷等[15]。
NIPT筛查的是孕妇外周血中胎儿游离DNA片段，而非完整的胎儿染色体，因此NIPT筛查需要对胎儿DNA测序数据进行过滤、筛选和换算处理，故NIPT筛查获得的胎儿DNA片段长度和位置变化并不精确[11,12]。当NIPT筛查结果提示存在胎儿染色体CNV可能时，应采取介入性产前诊断进行确诊，除了常规染色体核型分析外，还应建议对该类胎儿染色体CNV疑似孕妇进行CMA检测，以明确胎儿染色体CNV、变异的DNA片段长度和位置。常规染色体核型分析对染色体结构变异的分辨率较低，一般只能观察到5~10 Mb及以上的染色体结构异常。本研究通过CMA明确诊断的35例胎儿染色体CNV中，仅13例通过常规染色体核型分析检测到胎儿染色体异常，而且仅11例核型异常结果与NIPT提示的胎儿染色体CNV基本相符，这些异常的DNA片段长度均>5 Mb，该方法对胎儿染色体CNV的检出率仅为16.4%(11/67)。因此，若对NIPT筛查结果发现疑似胎儿染色体CNV的孕妇，仅采取常规染色体核型分析，可能导致染色体CNV胎儿被漏诊。
CMA能在全基因组范围内扫描，可分辨的DNA片段为50~100 kb，比常规染色体核型分析的DNA片段长度的分辨率提高近1 000倍，可检测常规染色体核型分析难以发现的微缺失和微重复、部分嵌合体、杂合性缺失、单亲二倍体等，并且能检测发生染色体CNV的DNA片段精确长度及位置变化。本研究结果显示，37例明确诊断胎儿染色体异常的病例中，CMA结果显示35例胎儿染色体CNV，29例与NIPT筛查结果提示存在的胎儿染色体CNV基本相符，二者符合率为43.2%(29/67)；而另外2例经染色体核型分析确诊为胎儿染色体平衡易位核型者，CMA却未能发现胎儿染色体异常。对于表1中病例No.7、22、33，NIPT筛查结果提示存在胎儿染色体部分片段缺失，CMA证实这3例分别存在3、14、21号染色体杂合性缺失，异常的DNA片段均>10 Mb，而常规染色体核型分析，却未能发现异常。病例No.23的NIPT筛查结果提示存在胎儿性染色体偏多，染色体核型分析及CMA均证实存在性染色体低比例嵌合，此外CMA还检测到该例胎儿15号染色体有329.0 kb的DNA片段缺失，经生物信息学分析，考虑为pCNV。谢润桂等[16]研究结果显示，CMA可对染色体CNV进行验证。另外，本研究未能收集到所有胎儿染色体CNV的来源验证及产后随访数据，故未对胎儿的临床转归进行分析，也未能对NIPT筛查结果呈阴性的孕妇进行相关研究。因此，对NIPT筛查胎儿染色体CNV结果的评价尚不全面，仍有待进一步研究。
NIPT作为一种高精准产前筛查手段，能够检出部分有临床意义的胎儿染色体CNV，因此将NIPT筛查范围扩大到对胎儿染色体CNV筛查，从技术层面而言是可行的。但是，该技术的筛查结果存在一定假阳性，故当NIPT结果提示存在胎儿染色体CNV时，应结合其他产前诊断方法进一步验证，做出准确诊断，以减少漏诊和误诊。
所有作者均声明不存在利益冲突
