人体生命早期呼吸系统菌群的组成(种类与数量)是近年儿童呼吸领域的研究热点之一，越来越多研究提示，人体生命早期呼吸道暴露于细菌环境，是影响肺部免疫系统发育的重要因素。呼吸系统菌群组成，可影响肺功能和呼吸生理，影响机体对呼吸系统病原体及外界刺激的易感性。生命早期是外界环境刺激与微生物组定植的最初暴露期，也是肺发育的关键时期。人体生命早期肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态，可能影响肺免疫细胞分化和成熟，若肺定植微生物组失调，可能增加肺感染风险。研究表明，呼吸系统菌群随着肺疾病发生而变化，并且与肺疾病的严重程度有关。因此，探讨肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态和宿主相互作用，对研究肺感染疾病发病机制至关重要。笔者拟对人体生命早期呼吸系统菌群组成及其来源，影响人体生命早期肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态因素，呼吸系统正常菌群对肺部免疫系统调节作用，以及人体生命早期呼吸系统菌群异常与肺感染疾病等的最新研究进展进行阐述。
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人体生命早期肺部微生物早期定植，可促进机体免疫系统发育和免疫记忆形成，这种相互作用存在关键的窗口期，若被干扰，将导致免疫细胞发育和功能不可逆缺陷。因此，研究对肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态，有助于明确与免疫调控相关的肺部微生物组成，为肺部感染疾病诊疗提供新的有效靶点[1]。呼吸道与外界相通，呼吸道上皮表面有多种微生物定植，包括细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等[2]。整体而言，目前对呼吸系统微生物组学的临床研究匮乏，一方面是因为肺部微生物群落细菌负荷低，取样困难，容易受到污染；另一方面，呼吸道内镜检查和肺泡灌洗液采集为有创性操作，对健康儿童采样存在医学伦理问题。目前对呼吸系统微生物组研究多集中于呼吸系统感染患儿的细菌群研究，本研究亦主要阐述呼吸系统感染患儿的呼吸系统细菌群的最新研究现状。以环状软骨为界，呼吸道被分为上、下呼吸道，上呼吸道包括鼻腔、咽、喉，下呼吸道包括气管和支气管、肺内各级支气管、呼吸区(肺泡)。呼吸道表面覆盖着一层黏液，含有溶菌酶、免疫球蛋白和黏液蛋白，可以吸附尘埃、毒素、病原微生物、变态反应原等。呼吸道不同部位的上皮细胞类型、纤毛细胞功能、黏液蛋白量及局部的温度、pH值、氧张力和局部黏膜免疫反应等特性不同，为呼吸系统微生物组定植创造独特微环境[3]。肺曾被认为是无菌的，然而相关研究表明，虽然肺部菌群数量低，但是种类亦较多[4]。呼吸系统正常菌群定植着生态位特定微生物群落，保护呼吸系统免受病原体侵袭[5]，并可促进肺部免疫系统发育，防止肺部疾病的发生[6]。呼吸系统菌群组成(种类及数量)异常，与机体发生哮喘，支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)及儿童迁延性细菌性支气管炎(protracted bacterial bronchitis，PBB)等呼吸系统疾病相关[7]。人体生命早期肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态，可能影响肺免疫细胞分化和成熟，肺免疫系统发育过程中，肺定植微生物组失调，可能导致肺部疾病的发生[8]，但是对新生儿肺部微生物组建立机制及其与肺部疾病关系，则迄今尚未阐明[9]。呼吸系统菌群影响肺部免疫细胞分化和成熟方式，可能与肠道菌群的影响相似[10]。笔者拟对人体生命早期呼吸系统菌群组成及其来源，影响生命早期肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态因素，呼吸系统正常菌群对肺部免疫系统调节作用，以及人体生命早期呼吸系统菌群异常，在肺部疾病中的潜在致病机制的最新研究进展进行阐述。
人体生命早期呼吸系统菌群组成相关研究，受到医学伦理挑战。对健康婴幼儿的鼻、咽拭子标本分析结果显示，生后42 d龄时，鼻、咽菌群以葡萄球菌、链球菌、莫拉菌、棒状杆菌和狡诈菌属占主导；2岁后，则以莫拉菌、链球菌和嗜血杆菌占主导[11]。与上呼吸道鼻、咽拭子标本相比，下呼吸道抽吸物标本来源有限，菌群组成研究更具挑战性[12]。由于支气管镜无法直接进入远端肺组织，气管抽吸物是评估新生儿下呼吸道和远端肺组替代标本[8]。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应DNA序列。对该基因高度可变序列的分析，有助于在门、属或物种水平识别特定细菌，在细菌分类中具有重要作用[13]。Lal等[14]采用16S rRNA基因测序技术，分析51例生后6 h龄新生儿气管抽吸物标本结果表明，其呼吸道菌群以厚壁菌门和变形菌门为主，其次为放线菌门、拟杆菌门、软壁菌门、梭杆菌门和疣微菌门细菌。在人体生命早期，呼吸道菌群呈快速、动态发展，细菌数量在生后1 d时最低，此后大幅增加，直至保持稳定，并且发展成特定菌群，下呼吸道菌群种类和数量在生后2个月时达到比较稳定状态[15]。Thorsen等[16]对700例健康儿童的前瞻性队列研究发现，婴幼儿生后7 d、1个月、3个月时，呼吸系统菌群均以厚壁菌门和变形杆菌门为主，特别是葡萄球菌属、链球菌属、莫拉菌属、嗜血杆菌属和棒状杆菌属随着月龄增长而增长，同时葡萄球菌属细菌数量减少，而链球菌、莫拉菌和嗜血杆菌属细菌数量则增加；一些丰度相对较低的菌属，如奈瑟菌、梭杆菌和普雷沃菌属细菌数量变化亦较大，从生后7 d到生后3个月可增加数倍。
关于人体生命早期呼吸系统微生物来源，有学者认为其定植过程可能开始于产前，支持证据包括：羊水可被各种微生物污染[17]，由于胎盘检测可见丰富微生物组[18]，阴道分娩和剖宫产术分娩新生儿的呼吸系统菌群种类和数量相似[14]。另有学者认为，不同分娩方式早产儿呼吸系统菌群存在差异，这符合呼吸系统菌群定植主要发生在出生期间和(或)出生后的假设[19]。分娩方式对人体生命早期呼吸系统菌群定植的影响及其对人类健康的影响，迄今尚存在争议[20]。
基于解释肺微生物组在肺炎中可能起作用的"肺生物地理学适应性岛屿模型"认为，呼吸系统是一个完整的生态系统，从鼻腔延伸到肺泡，生命早期肺部微生物组发育受到上呼吸道微生物组不断迁移影响[21]，使肺部微生物组与上呼吸道微生物组具有相似性[22]。肺部微生物组不同于上呼吸道微生物组的独特特征包括：①肺部微生物组数量远低于上呼吸道，并且随着肺部与上呼吸道距离增加，肺部微生物组种类逐渐降低，采用16S rRNA技术分析结果显示，上呼吸道微生物组数量为肺部的100~10 000倍[23]。②相比于其他部位，肺部微生物组数量和种类与口腔内的更相似。③肺部微生物组呈动态变化状态。健康个体生命早期肺部微生物组发育特征及早期微生物组稳态是由肺部微生物迁入、清除和繁殖率3项因素的动态平衡状态决定[23]。肺部微生物迁入由空气中微生物吸入、上呼吸道和口腔定植菌微量吸入(以下简称为"微吸入")及沿呼吸道黏膜表面直接分散驱动。由于口腔和肺部微生物组具有相似性，微吸入可能是机体呼吸系统微生物迁入的主要途径[24]。下消化道微生物组为肺部微生物组的潜在来源，胃、食管功能障碍和反流患者的消化道微生物组不同，通过微吸入方式导致其肺部微生物组亦不同[25]。肺部微生物清除是呼吸系统黏液、纤毛清除及咳嗽与激活宿主炎症细胞联合作用的结果。肺部微生物组繁殖率，取决于肺部环境特征，即动脉血氧分压、pH值、血液供应、肺泡通气量、温度和炎症细胞数量及功能等。正常情况下，肺部微生物组与其早期微生物稳态，主要由肺部微生物迁入和清除率决定，而发生肺部疾病所致肺部微环境改变，可使肺部微生物迁入和清除平衡紊乱[22]，有害微生物迁入率增高，而清除率降低，均可影响肺部微生物组稳态[26]。随着肺部疾病恶化，肺部微环境及微生物繁殖率进一步失衡，进而加重肺部微生物组稳态失衡。疾病治疗亦可致肺部微生物组发育和早期微生物组稳态失衡，如吸氧、抗菌药物治疗、全身和吸入性皮质类固醇等，均可对肺部微生物迁入、清除和繁殖率产生影响[27]。
肺部微生物组的发现，进一步加深临床对呼吸系统感染疾病发病机制的认识[28]。呼吸系统异常，并非单纯由病原体入侵所致，是呼吸系统菌群紊乱和宿主免疫反应失调影响宿主免疫功能的缘故[21]。呼吸系统正常菌群在急性肺部感染疾病中，具有调节肺部炎症反应及其内皮细胞通透性的作用，在感染防御和转归中发挥重要作用[29]。Wang等[30]研究发现，定植于小鼠上呼吸道黏膜的金黄色葡萄球菌，可通过诱导肺泡巨噬细胞，抑制流感病毒介导的肺损伤，即金黄色葡萄球菌定植于上呼吸道被宿主细胞识别，外周血中的单核细胞被募集到肺泡，在Toll样受体2信号通路调控下，极化为M2型肺泡巨噬细胞后，通过分泌抗炎介质和表达抑制配体抑制炎症反应，减轻流感病毒介导的急性肺损伤及炎症反应。Wu等[31]研究发现，健康小鼠单次吸入人类口腔共生菌混合物后，可引起小鼠肺部菌群发生短暂紊乱，诱导小鼠肺部发生辅助性T细胞(helper T cell，Th)17型反应，并可持续≥14 d，降低小鼠对肺炎链球菌的易感性。这提示，小鼠对人类口腔微生物偶发性微吸入，在调节肺部免疫功能和减轻病原体易感性方面具有保护作用。Stankovic等[32]采用外源性脂多糖刺激人支气管上皮细胞的体外研究结果发现，乳酸菌菌株BGZLS10-17和BGPKM22可以减少支气管上皮细胞促炎基因表达，使脂多糖诱导的炎症反应显著降低，其抗炎分子机制为：脂多糖被受体识别后，激活核因子-κB和丝裂原激活蛋白激酶，促进促炎基因转录，而乳酸菌菌株BGZLS10-17和BGPKM22可影响核因子-κB核转位功能，降低丝裂原激活蛋白激酶信号级联反应，从而抑制促炎基因表达[32]。由此可见，在肺部急性感染诱发炎症反应中，呼吸系统正常菌群发挥着重要调节作用。
CD4+ T细胞识别主要组织相容性复合物间隙中的抗原，通过细胞因子和共刺激分子活化，分化为Th与调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)等。Th又被分为Th1和Th2效应细胞。Th1主要分泌白细胞介素(interleukin，IL)-12，γ干扰素和转化生长因子β，激活巨噬细胞并引起细胞毒性，介导细胞免疫。Th2主要分泌IL-4、-5、-13，激活B细胞产生免疫球蛋白，介导体液免疫[33]。与成年人相比，新生儿CD4+ T细胞的效应能力具有特异性[9]。在成年人中，幼稚CD4+ T细胞受病原体抗原刺激后，主要分化为Th1，而Th1通过分泌γ干扰素和肿瘤坏死因子-α，为病原体提供保护作用。新生儿的幼稚CD4+ T细胞对病原体反应，则主要诱导Th2免疫反应。随着新生儿生后呼吸道上皮的模式识别受体不断受到共生细菌成分，包括脂肽、肽聚糖、脂多糖和DNA等刺激，肺部幼稚T细胞将从诱导Th2向Th1极化转变[34]。若此时肺部缺乏微生物刺激，将影响肺部幼稚T细胞诱导方向转换。Gollwitzer等[35]采用屋尘螨提取物鼻内刺激，使生后3 d小鼠致敏的研究发现，其呼吸道嗜酸性粒细胞增多并释放大量Th2因子致呼吸道高反应。再将致敏小鼠在在无特异性病原体环境中饲养2周后再次进行上述操作，则可降低小鼠对屋尘螨的呼吸道高反应性。小鼠呼吸道对变态反应原的高反应性降低，与其肺部Helios呈阴性的Treg发育有关，而呼吸系统正常菌群定植与稳态，可促进此类Treg发育[35]。由此可见，呼吸系统正常菌群对促进肺部T细胞表型转换及加强对变态反应原耐受性具有重要作用。
人体生命早期呼吸系统菌群种类与数量异常，可影响肺部免疫细胞分化和成熟，参与肺部疾病发生与发展[36]。肺部疾病发生又可导致呼吸系统菌群种类和数量显著变化，影响药物治疗的临床效果。呼吸系统菌群失衡不仅与化脓性肺炎和囊性肺纤维化(cystic pulmonary fibrosis，CPF)发生相关，而且与哮喘、BPD和肺纤维化等疾病发生亦相关[37]。
极早产儿出生时肺部发育不成熟，容易发生多重损伤，干扰肺泡和血管发育，导致BPD[38]。呼吸系统菌群失衡在BPD发病机制中作用迄今仍未阐明。肺部炎症标志物与BPD发病相关[39]。Lal等[14]对5例BPD患儿的研究发现，随着病情进展，其呼吸系统菌群中相对丰度最高的为肠杆菌科变形杆菌，而厚壁菌、放线菌、拟杆菌的相对丰度，则较同胎龄的非BPD患儿降低，并且差异有统计学意义(P＝0.002)；同时对23例出生胎龄相似的极低出生体重儿，根据其是否发展为BPD，将其分为非BPD组(n＝13，未发展为BPD者)和BPD组(n＝10，发展为BPD者)，回顾性分析其校正胎龄为36周时的肺部结局显示，与非BPD组相比，BPD组极低出生体重儿出生时的呼吸道乳酸杆菌丰度更低，并且差异有统计学意义(P＝0.04)。
哮喘是一种多因素所致疾病，被认为与遗传和环境因素(空气污染和变态反应原)有关，在发达国家中，人群哮喘发病率较发展中国家更高[40]。呼吸系统菌群多样性和组成受生活环境影响，在哮喘发生和发展中起着重要作用[41,42]。呼吸系统菌群种类和数量在健康个体和哮喘患者中差异很大，哮喘患者呼吸系统菌群紊乱与炎症发生率增高有关。Losol等[43]对7篇评估哮喘与上呼吸系统菌群失调关系文献进行系统分析的结果显示，与对照组(健康儿童)相比，哮喘组患儿上呼吸系统菌群中的变形杆菌和厚壁菌占比更高，而莫拉菌、链球菌和嗜血杆菌占主导地位，差异均有统计学意义(P＝0.005 4)。Thorsen等[16]纳入700例健康儿童上呼吸系统菌群组成的前瞻性队列研究发现，1个月龄时，若其韦氏球菌属和普氏菌属相对丰度较高，则与其6岁时发生哮喘有关(P＝0.000 5)。
囊性纤维化(cystic fibrosis)是一种累及多器官的常染色体隐性遗传疾病，由于囊性纤维化跨膜电导调节基因缺陷所致全身外分泌腺大量黏液阻塞，进而累及呼吸、消化、生殖等全身多系统。呼吸系统菌群异常在CPF发生、发展中扮演重要角色，慢性呼吸系统感染和炎症所致进行性阻塞性肺病，是CPF患者病情加重和导致患者死亡的主要原因[44]。与健康儿童相比，CPF患儿呼吸系统菌群多样较低，呼吸系统菌群异常在CPF发展中发挥重要作用[45]。O′Connor等[44]按照是否发生CPF，将191例0~21岁受试者分为CPF组(n＝63)与健康对照组(n＝128)，回顾性分析其支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BLF)标本的结果显示，约2岁时，CPF组患者的BLF菌群多样性与健康对照组存在显著差异，差异有统计学意义(P＝0.001)；CPF组患者BLF菌群种类较健康对照组更少，特别是在2~5岁和6~10岁年龄段时，这种减少更明显，并且该差异可持续到成年期；CPF组患儿2岁时，BLF菌群种类以嗜血杆菌为主，2~10岁时，则以金黄色葡萄球菌和窄食单胞菌属为优势菌群，并伴随着链球菌组相对丰度降低、BLF菌群数量增高和菌群多样性下降，与健康对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。
Narang等[46]对PBB患儿6个肺叶，包括舌叶进行BLF样本的病原菌分析结果显示，其中包括流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌和金黄色葡萄球菌。由于PBB患儿肺内病原菌分布存在异质性，如果BLF标本采集仅限制在1叶肺，则可能导致标本采集不全，致病菌检测结果不准确，因此采取多点采样对判断PBB患儿肺内病原菌具有重要意义。2017年，英国对采用气管刷采集的PBB组患儿(n＝24)与健康对照组(n＝20)受试儿BLF标本，采用16S rRNA基因测序技术进行菌落分析发现，PBB组患儿的BLF菌群多样性显著低于健康对照组儿童，并且差异有统计学意义(P＝0.001)，PBB组患儿BLF标本中，嗜血杆菌、奈瑟菌、链球菌和莫拉菌占主导[47]。
综上所述，随着高通量测序技术的发展，使得临床对人类呼吸系统微生态的了解不断深入。人体生命早期呼吸系统菌群定植，在肺部免疫系统发育过程中起着重要作用，若该窗口期受影响，则可能对人体的影响是长期的。人体生命早期肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态，与其肺部健康密切相关，并且互相影响，肺部疾病的发生，可导致呼吸系统菌群种类和数量变化。随着临床对肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态的了解不断深入，对宿主肺部疾病的发生机制将被进一步阐明。
所有作者声明无利益冲突
陈玉莲，刘瀚旻.人体生命早期呼吸系统菌群与肺部微生物组发育特征及早期菌群稳态研究现状[J/OL].中华妇幼临床医学杂志(电子版), 2023, 19(1)：31-37.
