目前，异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是国内外公认的治疗血液系统恶性肿瘤的最有效手段之一。外周血和骨髓中不同亚型细胞的生物学特征存在差异，allo-HSCT后供、受者免疫细胞嵌合状态演变是一个复杂的过程。移植后供者各种免疫细胞亚群的嵌合状态分析因其极高的敏感度和特异度，在判断allo-HSCT的临床效果、疾病转归、提高移植术后受者生存率等方面发挥着重要的临床指导意义。本文就allo-HSCT后供、受者间各种免疫细胞嵌合状态监测的临床意义作一综述。
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异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)后移植物的早期植入、移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发生及原发病复发是决定移植成败的关键问题，移植后动态监测供、受者免疫细胞嵌合状态有助于尽早判断植入情况、是否发生排斥反应及预防复发[1]。供者源性免疫细胞分选嵌合状态的分析是一种简单、有效的监测方法，目前普遍运用于细胞嵌合状态研究的方法主要包括基于PCR扩增短串联重复序列(short tandem repeat，STR)技术的全血细胞嵌合状态分析及结合细胞分选技术的各系免疫细胞嵌合状态监测。不同STR位点的各种等位基因具有特征性，allo-HSCT后STR位点监测可判断受者体内细胞的来源。因此，STR-PCR技术结合免疫细胞分选技术可通过检测供者各系免疫细胞嵌合水平，从而反映移植物在受者体内的植入情况，对需要动态监测移植效果及进行早期临床干预的allo-HSCT受者尤为适用[2]。
供者造血干细胞嵌合状态是指allo-HSCT后供者来源造血干细胞存在于受者体内的现象，这种状态下，供、受者细胞通过多种机制形成双向免疫耐受[3]。全血细胞嵌合状态研究是指分离受者骨髓或外周血中的有核细胞，进行移植物来源的分析，得到嵌合体中供者DNA所占百分比，并据此指导临床干预治疗及判断预后；与分析各系免疫细胞的嵌合状态相比，其结果为各种细胞嵌合比例的混合，较为笼统，针对性差[4]。
细胞嵌合状态可分为完全嵌合状态(complete chimerism，CC)、混合嵌合状态(mixed chimerism，MC)、短暂MC、稳定MC和不稳定MC。CC为供者细胞完全嵌合，供者细胞嵌合率≥95%；MC为受者骨髓或外周血中可同时检测到供、受者细胞，5%≤嵌合率<95%；短暂MC为allo-HSCT后出现一过性MC，之后骨髓或外周血中受者细胞消失，MC转化为CC；稳定MC为供者细胞比例保持恒定，90%<嵌合率<95%；不稳定MC为骨髓或外周血中受者细胞比例增加，之后嵌合率逐渐降至90%以下[5]。STR-PCR技术已被国际骨髓移植登记组推荐为allo-HSCT后定量监测供者细胞嵌合状态的金标准，具有简便、快捷、可靠、敏感度高、不受性别限制、所需标本量少等优点，且在移植后早期粒细胞极度缺乏状态下也可进行监测[6]。
分选嵌合是指以单个核细胞为起点，用免疫磁珠分选各系细胞，并结合STR-PCR技术建立的免疫细胞嵌合性定量分析方法。因外周血和骨髓中各系细胞的生物学特性存在差异(如生存时间、功能、植入动力学等方面)，使它们对评估移植后相关临床事件的敏感度和特异度不尽相同。有研究表明，移植后供者各系细胞在受者体内的植入并不完全同步，淋巴系细胞完全嵌合状态出现时间早于髓系细胞(CD14＋/15＋细胞)[7]。淋巴系细胞中，出现CC的先后顺序依次为：NK细胞、T细胞和B细胞[8]。全血嵌合状态监测因无法准确反映全血中各系免疫细胞亚群嵌合状态而导致其应用受限。近年来，大量研究证实这些免疫细胞亚群嵌合状态对评估allo-HSCT受者预后具有重要意义[9,10,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28]，因而细胞分选嵌合分析较全血嵌合分析更能为判断植入情况、预测GVHD及原发病复发提供确切的信息，针对性更强。
allo-HSCT后供者细胞在受者体内是否植活对判断移植成功与否和疾病转归具有重要价值，移植后通过检测供、受者细胞嵌合状态，可尽早评估供者细胞在受者体内的植入情况。有研究表明，在allo-HSCT术后早期，供者细胞已经开始植入，随后增殖、分化、释放到外周血以促进受者造血功能恢复，即分子水平植入(首次嵌合率>50%)的时间比受者造血功能重建时间早4～7 d[3]。各系免疫细胞的植入动力学存在差异，免疫细胞分选嵌合可针对性地反映供者各免疫细胞亚群的嵌合情况，较全血细胞嵌合状态监测而言，对移植后早期植入情况能做出更具特异性的判断。
各系细胞植入的先后顺序与受者原发疾病、预处理方式和强度以及免疫抑制方案等相关。Baron等[11]研究发现，移植后NK细胞的植入较T细胞早，NK细胞植入中位时间为allo-HSCT后14 d。蒋瑛等[12]研究表明，allo-HSCT后早期供者NK细胞达到CC预示移植物早期植入，而T细胞达到CC时间最晚，将T细胞完全嵌合作为移植物稳定植入的指标更为合理。Childs等[13]研究表明，采用非清髓性预处理方案后行allo-HSCT的受者中，T细胞达到CC的中位时间为移植后30 d，早于髓系细胞。因此，监测各系免疫细胞嵌合状态更能有针对性地判断allo-HSCT后移植物早期植入和稳定植入情况。
排斥反应是allo-HSCT后一种严重并发症，移植后14 d供者细胞是否达到MC对预测移植术后早期是否发生排斥反应具有重要意义[7]，因而嵌合状态的监测可为预测移植物排斥反应提供有力依据。有研究表明，allo-HSCT后14 d供者T细胞和(或)NK细胞嵌合率<50%是发生排斥反应的危险因素[7]；移植后28 d，供者T细胞嵌合率<90%的受者排斥反应发生率高[14]。Breuer等[15]对192例行allo-HSCT儿童受者(包括恶性和非恶性血液病)进行特定细胞(包括T细胞、NK细胞及粒细胞)嵌合状态监测，发现移植后早期供者T细胞嵌合率>50%的受者发生排斥反应风险低，T细胞和NK细胞嵌合率均<10%的受者移植失败风险高。还有研究发现，allo-HSCT后28 d，继发于T细胞MC的NK细胞嵌合率下降，对预测排斥反应更有价值[16]。上述研究提示，allo-HSCT后早期若相继出现T细胞和NK细胞的MC状态，往往提示排斥反应发生风险高。
GVHD是allo-HSCT后特有并发症，是移植后受者非复发死亡率上升及无进展生存率降低的主要原因之一。通过分析各系细胞亚群嵌合率改变可较早预测GVHD，指导临床尽早干预，提高allo-HSCT受者生存率。
急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease，aGVHD)是allo-HSCT后由活化的供者来源T细胞识别组织不相容的受者抗原和细胞，并与之发生反应而引发。allo-HSCT后受者aGVHD的发生与T细胞嵌合状态关系密切。对于Ⅱ～Ⅲ级aGVHD，T细胞CC被证明是最具相关性的危险因素[17]。有研究表明，allo-HSCT后早期T细胞CC受者aGVHD发生风险高于MC受者[18]；移植后7 d T细胞嵌合率>69%受者发生aGVHD风险高[19]；移植后14 d T细胞嵌合率70%～90%及移植后28 d T细胞嵌合率>90%受者发生Ⅱ～Ⅳ级aGVHD的风险明显升高[11]。同时，Guz等[20]研究表明，allo-HSCT后T细胞嵌合状态监测对预测急性髓系白血病患者allo-HSCT后aGVHD的发生具有重要临床价值。一项针对14例再生障碍性贫血患者行allo-HSCT后T细胞嵌合状态监测的研究表明，发生与未发生aGVHD的受者首次达到CC的时间均为移植后14 d(这可能与该研究的样本量较少有关)；而在移植后2个月，T细胞处于高比例嵌合(嵌合率≥90%)的受者aGVHD发生率明显高于嵌合率<90%的受者[21]。此外，调节性T细胞是公认的具有抑制GVHD作用的T细胞亚群[22]，但目前对allo-HSCT后该T细胞亚群嵌合状态的研究尚不足，仍需进一步探究其在预测GVHD中的作用。
慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease，cGVHD)由于发病原因不明，预防措施有限，不同细胞亚群分选嵌合状态监测对及时预测cGVHD发生尤为重要。现有研究表明B细胞亚群可参与抑制cGVHD的发生[23]。Perruche等[24]研究表明，经非清髓性预处理后行allo-HSCT的受者，其供者来源B细胞的低嵌合状态可能导致受者自身抗体大量产生，从而导致cGVHD发生。但由于cGVHD病因不明且影响因素众多，关于B细胞嵌合状态与cGVHD发生之间的关系需要更多研究证实。
上述研究表明，allo-HSCT后T细胞及B细胞嵌合状态的动态监测有助于预测移植后aGVHD及cGVHD的发生，较NK细胞及粒细胞更敏感。因此，动态监测移植后供者来源T细胞和B细胞的嵌合状态，可早期预测GVHD，指导临床合理进行免疫抑制治疗，使其最大限度发挥预防GVHD作用的同时，不抑制移植物抗肿瘤(graft versus tumor，GVT)效应。
移植后原发病复发依然是allo-HSCT后受者面临的主要问题。复发可表现为分子生物学复发(供者细胞嵌合率下降)、血液学复发(外周血中再次出现白血病细胞或骨髓幼稚细胞比例>5%)及细胞遗传学复发(移植后已达到细胞遗传学完全缓解的受者再次出现原有的细胞遗传学异常)。其中基于供者细胞嵌合状态监测的分子生物学复发检测较细胞遗传学复发检测适应症更广，此外亦可弥补血液学复发检测难以在移植后早期预测疾病复发的缺陷，因而更具临床应用价值。
原发病复发时，供者细胞嵌合率呈下降趋势，而各系细胞MC出现的先后顺序取决于原发血液系统疾病及受累细胞类型。allo-HSCT后早期(移植后30 d)监测各系细胞嵌合状态对预测复发更有应用价值[25]。Lee等[26]对达到完全缓解后的急性髓系白血病患者行allo-HSCT，移植后监测受者体内供者细胞嵌合状态，结果发现供者T细胞CC和最大化GVT效应对维持疾病完全缓解具有重要意义；移植后28 d，T细胞嵌合率<90%预示疾病早期复发风险增加，无进展生存率降低，且疾病复发时T细胞嵌合率降低程度较粒细胞明显。一项针对B细胞白血病患者allo-HSCT后嵌合状态监测的研究发现，原发病复发时B细胞嵌合率首先下降，且下降幅度大于T细胞及NK细胞[27]。Jiang等[28]研究指出，非B淋巴细胞白血病患者在复发前两周，骨髓NK细胞嵌合率下降2.8%，而T细胞仍提示完全嵌合，且复发时监测NK细胞嵌合率的下降幅度大于T细胞；由此研究者推测，对于非B淋巴细胞白血病患者，NK细胞嵌合状态监测对判断allo-HSCT后原发病复发的敏感度高于T细胞。但该研究中纳入的非B淋巴细胞白血病不包括急性T淋巴细胞白血病(T-lineage acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)，由于T-ALL是一种罕见的高侵袭性白血病，目前关于这类患者allo-HSCT后复发的独立研究较少，尚不能推测T细胞嵌合率监测在预测T-ALL复发中的变化规律，这也是在今后的临床诊治中我们需关注总结的一类病例。
此外，allo-HSCT后微小残留病灶(minimal residual disease，MRD)的检测对于预测移植后原发病复发也具有一定的临床价值。目前MRD检测的方法主要有流式细胞术(flow cytometry，FCM)和PCR技术。FCM检测的MRD为白血病相关免疫表型，敏感度达1×10－4左右，其监测急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)患者移植后MRD的敏感度和特异度高于急性髓细胞性白血病，但该方法在移植后各监测时间点的意义、抗体组合及界值尚未达到标准化[29,30]。PCR技术主要通过检测肿瘤特异性基因(特异性分子生物学标志物)发现MRD，敏感度可达1×10－5～1×10－6[29]，但该技术只能检测特异性基因且仅40%的ALL患者具有可被检测的特异性基因，使其应用范围受限；同时，由于部分基因存在不同的变异类型，从而导致其检测结果可能存在假阴性[30]。与上述两种方法相比，各种免疫细胞嵌合状态监测对预测allo-HSCT后原发病复发的适用范围更广泛，不受疾病类型及疾病特异性致病基因的限制，同时可运用于移植后早期监测，具有临床推广价值。
免疫抑制剂能够抑制淋巴细胞功能并减少炎性细胞因子产生，预防GVHD，有助于移植受者长期生存及移植物保持良好功能。通过密切监测供者来源淋巴细胞亚群嵌合情况，可指导临床合理调整免疫抑制剂剂量，使其发挥预防GVHD作用的同时不削减GVT效应[31]。Breuer等[15]研究表明，移植后早期T/NK细胞嵌合率低下受者，常常提示发生移植物排斥反应，需通过加强免疫抑制治疗提前预防。此外还有研究指出，在证实MC且尚未发生GVHD时立即输注供者淋巴细胞(donor lymphocyte infusion，DLI)和降低免疫抑制剂剂量，可使MC转化为CC，降低原发病复发率[32]。
DLI是一种过继性免疫治疗，其原理为供者T细胞发挥移植物抗宿主效应，消除残留病灶并建立CC，提高移植成功率[33]。DLI已被证实能使移植后复发的慢性粒细胞白血病患者再次获得完全缓解，对急性粒细胞白血病疗效有限，对ALL则无效。因此，为提高急性白血病患者allo-HSCT后生存率，需更密切监测各系免疫细胞嵌合状态以早期识别疾病复发，争取在肿瘤负荷量较低时行DLI或其他有效临床干预，从而再次实现CC，改善预后[34]。研究表明，allo-HSCT后出现下列任一情况者可考虑实施DLI：DC下降，MC持续超过2周[35]。MC通常率先出现在CD4＋、CD8＋、CD19＋细胞亚群，而此时全血细胞嵌合状态检测仍提示CC[36]。还有研究表明，对仅存在T细胞嵌合率下降的受者行DLI，可再次达到CC，防止原发疾病复发；反之，治疗前NK细胞嵌合率下降则预示DLI效果不佳[15]。因此，我们推测早期监测到T细胞嵌合率下降时即行DLI能更加及时、有效地消除残留病灶，再次建立CC。此外，DLI后T细胞嵌合状态转变早于粒细胞等其他各系细胞，因此DLI后T细胞嵌合状态的监测有助于判断疗效及指导后续治疗，从而避免因过度治疗造成GVHD等严重不良反应，也可为进一步行二次移植提供参考。
随着allo-HSCT的广泛开展，移植后各系免疫细胞嵌合状态监测已逐渐成为常规检测项目，对嵌合状态的研究也不断深入[38]。随着监测方法的改进及涉及范围的扩大，细胞分选嵌合状态监测不仅在allo-HSCT后判断移植物植入、排斥反应、预测GVHD、预防原发病复发及指导临床干预治疗等方面发挥积极作用，也为推动移植相关学科的发展提供了新的思路与方法。
此外，我们发现移植后各淋巴细胞亚群的嵌合率变化受基础疾病、预处理方案、造血干细胞来源及移植物组成等多种因素的影响，因而我们希望通过收集整理临床数据，对不同变量下的嵌合率演变规律进行归纳总结，进一步为移植后临床治疗与预后监测提供有益帮助。
