缺血再灌注损伤(IRI)是肝移植术中不可避免的病理生理变化，是引起肝损伤的一个重要原因，可能导致肝功能衰竭，影响肝移植受者术后的近、远期疗效。参与肝脏缺血再灌注的分子进程复杂多样，所涉及的机制在很大程度上尚未阐明，并不断有新的复杂机制更新。本综述旨在总结一些重要的分子机制在肝脏IRI中的研究进展，同时概述减轻IRI的新兴策略，为临床提高肝移植疗效及移植肝生存率，提供理论和科学依据。
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肝脏缺血再灌注损伤(ischemic reperfusion injury，IRI)是肝移植术后肝功能衰竭的主要原因，需要有效的方法来预防或减轻这种肝损伤。参与肝脏IRI的分子机制复杂，本文旨在综述肝脏IRI的分子机制研究新进展，为临床发现新靶点改善肝脏损伤提供新方向。
IRI主要分为2种类型[1,2]：(1)热IRI，由肝细胞损伤引起，发生于在体肝移植手术、各种原因导致的休克或创伤(器官处于低血压灌注)，可导致肝脏甚至多器官功能衰竭；(2)冷IRI，由肝窦内皮细胞(hepatic sinusoidal endothelial cell，LSEC)损伤和微循环障碍引起，发生于肝脏体外保存阶段，随后在肝移植术中也伴随热IRI的发生。尽管2种类型的始发细胞损伤类型不一样，但二者具有相似的病理生理学机制，即局部固有免疫反应[3]。
2种类型IRI均涉及肝脏Kupffer细胞和中性粒细胞的激活、细胞因子和趋化因子的产生、活性氧(reactive oxygen species，ROS)的释放、细胞间黏附因子增加和循环淋巴细胞或单核细胞的浸润[4,5]。与肝移植的异源反应不同，缺血再灌注引起的组织炎症反应在再灌注后立即发生。这些炎症反应主要由模式识别受体系统介导。其中，因肝细胞损伤产生的内源性配体，即危险相关模式分子(danger associated molecular patterns，DAMPs)而非外源性配体起关键作用[3]。
IRI包括缺血和再灌注2个阶段：缺血阶段可表现为局部组织细胞代谢紊乱，包括糖原不断消耗、供氧缺乏和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)耗竭，导致肝实质细胞死亡；再灌注发生于缺血阶段之后，不仅表现为代谢紊乱，还发生严重的炎症反应，涉及直接和间接的细胞毒性机制。因此，深入探究肝脏IRI中发生的固有免疫反应很重要，有助于发现减轻肝脏IRI新的治疗策略，如抑制有害的促炎反应或促进有益的抗炎反应。
传统认为肝细胞对热IRI更敏感，而LSEC对冷IRI更敏感。然而，在病理条件下很难限制仅发生某一特定细胞类型的损伤。Kupffer细胞产生促炎介质起着关键作用，中性粒细胞也被激活并且招募于肝脏，随后在多个因素的影响下迁移到LSEC外影响肝脏实质细胞[6]。
LSEC是一种特异的内皮细胞，具有成百上千直径100～150 nm的小孔，渗透性较强，为肝脏血流在内皮下的开放通道，在肝脏再生、肝脏纤维化和肝脏肿瘤细胞转移等过程中起到重要作用[7,8]。
总体上，肝脏热IRI可概括为微循环障碍和内皮功能障碍。在肝脏热IRI早期(再灌注后2 h内)LSEC是主要的损伤位点[7,8]，也是早期微循环炎症细胞浸润的主要场所。Hide等[9]研究发现，热IRI可导致大鼠肝脏热IRI模型中肝脏微循环及内皮细胞功能障碍，减少Kruppel样因子2(Kruppel-like factor 2, KLF2)表达，降低一氧化氮(nitric oxide，NO)生物利用度，促进肝脏炎症反应和细胞凋亡。热IRI后期(再灌注后6～48 h)以多核中性粒细胞介导的肝脏实质细胞炎症反应为主，激活核转录因子(nuclear factor kappa B，NF-κB)，诱导多种促炎趋化因子、细胞因子和黏附因子的转录。Toll样受体-4 (toll like receptor-4, TLR4)主要表达于肝脏实质细胞，可激活NF-κB，是热IRI中关键的损伤分子[10]。
体外细胞实验已经证实，KLF2是层流剪切应力诱导血管内皮细胞表达的转录因子，在肺脏、内皮细胞和淋巴细胞中大量表达，且具有抗炎、抗血栓形成、抗氧化应激、抗凋亡等作用[11]。近年来很多学者通过不同方式上调KLF2表达，研究其对肝脏内皮细胞系统的保护作用及机制[12,13]。有研究显示[13]，在正常大鼠供肝保存过程中通过药物诱导KLF2表达，其下游内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)的表达增加，能减少超氧化物、剪切型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3和细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)生成，减轻氧化应激、细胞凋亡和炎症反应。Hide等[9]研究同样表明，在70%大鼠肝脏热IRI模型中，通过药物诱导KLF2表达，能上调eNOS、HO-1和TM的表达，抑制炎性细胞浸润和TLR4表达，改善LSEC功能，减少肝细胞凋亡，减轻肝脏热IRI。因此，上调KLF2表达可有效减轻肝脏热IRI。
Kupffer细胞在肝脏IRI病理生理机制中发挥核心作用。再灌注过程由2个阶段组成：初期肝脏中活化的巨噬细胞和Kupffer细胞产生大量ROS，诱导氧化应激；后期(再灌注后6～24 h)中性粒细胞聚集，释放可直接引起组织损伤的炎症介质。Kupffer细胞活化导致ROS的产生和释放以及炎症级联反应，包括释放促炎细胞因子如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和高迁移率族蛋白1(high mobility group protein1，HMGB1)[14]。与此同时，NO水平降低，使来自eNOS的内皮素-1和NO间的平衡打破，导致肝血窦血管细胞收缩。肝血窦内皮细胞间隙的缩小导致血小板和中性粒细胞聚集，进而释放氧化物和蛋白酶导致肝细胞损伤。另外，ROS在内皮细胞和肝细胞中激活氧化还原敏感性转录因子AP-1和NF-κB。
HMGB1是一种DNA结合蛋白，由非实质肝细胞(Kupffer细胞和内皮细胞)和嗜中性粒细胞主动分泌或坏死性肝细胞被动释放，可诱导炎性信号级联反应。正常大鼠HMGB1主要存在于肝细胞核中，大鼠肝脏部分热缺血60～90 min后，HMGB1从细胞核转移到细胞质，并在再灌注后1 h内释放到血液循环中；肝脏热缺血期间，HMGB1水平随固有免疫激活而增加，并持续反应24 h[15]。事实上，肝脏再灌注期间发生的炎症主要由固有免疫主导，其可能诱发肝脏实质和非实质细胞热IRI。Kupffer细胞激活后常见的CD4＋ T细胞也可被激活，在再灌注后1 h内积聚于肝脏，可导致肝细胞和LSEC损伤，最终导致肝细胞坏死[16]。
线粒体损伤也是IRI的主要潜在损伤机制之一。有研究表明，线粒体超氧化物于热缺血组织再灌注时期产生，主要由细胞内氧化呼吸链复合体Ⅰ的逆电子传输(reverse electron transport，RET)产生，可引发IRI[17]。RET具有独特的生理作用，是线粒体通过逆行氧化还原信号快速传达其状态的途径。RET使线粒体的2个核心功效结合：通过辅酶Q还原电位感测呼吸链的电子供应，以及由质子动力势能的大小反映ATP需求。因此，当线粒体无活性并且过量供应电子时，线粒体RET将被加速，当线粒体处于高活性时RET速度最小化。超氧化物将转化为过氧化氢，其可扩散至以修饰氧化还原性蛋白质硫醇作为氧化还原信号的胞质溶胶。在热IRI中，这种信号通路过度激活将导致氧化应激损伤[17]。
此外，核因子E2相关因子2(nrythrocyte related factor-2, Nrf2)也是近年来该通路中较为热门的研究对象。Nrf2是细胞抗氧化防御系统的主调节器，激活Nrf2可促进细胞生长和存活，并有助于在氧化应激损伤中启动细胞保护作用；抑制Nrf2则可促进高氧条件下引起的急性器官损伤和氧化应激介导的炎症细胞损伤[18]。此外，抑制Nrf2还会损害血管内皮细胞生成能力并减少抗氧化基因表达，导致心脏肥大，增加心肌纤维化和细胞凋亡。因此，Nrf2对防御氧化应激至关重要，并且可能是调节器官损伤炎症反应、抗氧化应激的决定性分子。有学者已经确定Nrf2-Akt-FoxO1轴是IRI肝脏炎症反应的调控通路，Nrf2的激活减少巨噬细胞/中性粒细胞聚集，增强抗凋亡功能，并在抑制FoxO1信号时增加HO-1和信号转导及转录活化因子3表达，最终改善肝脏热IRI，这项研究揭示了PI3K-依赖型通路和Nrf2-Akt-FoxO1综合信号网络之间的交互作用以及TLR4介导的固有免疫反应[19]。
有证据显示肝脏IRI伴随肝脏组蛋白乙酰化作用显著减少，表明组蛋白乙酰化作用在热IRI中可能发挥重要作用，提示干预这一病理过程可能有助于缓解肝脏IRI[20]。组蛋白乙酰化具有重要的生理作用，组蛋白乙酰化转移酶促使组蛋白乙酰化，使得染色质舒张，进而诱导某些基因表达；其次，在肝脏脂肪变性的小鼠热IRI模型中证明基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP9)通过血小板内皮细胞黏附分子-1依赖机制破坏血管完整性，并干扰肝脏再生[21]。
研究发现脂质代谢在肝脏热IRI中也起到重要作用[22]。脂肪组织不是脂肪肝能量供应的来源，肝脏切除时ATP水平可以维持正常，但其产生的脂肪细胞因子对肝脏再生至关重要[22]。脂联素在非脂肪肝IRI中通过激活AMPK/eNOS相关通路改善肝脏损伤；但在脂肪肝IRI中，脂联素通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路，促进氧化应激，导致肝脏功能恶化[23]。因此，脂联素的作用依赖于肝脏不同的基础表型，涉及不同的信号通路。在脂肪肝或非脂肪肝IRI中，调节视黄醇结合蛋白4表达可加重肝脏损伤，不建议作为一种潜在的干预对象[24]。抵抗素和内脂素有一定的关联性，但在脂肪肝中不存在这种现象；在脂肪肝中内生的抵抗素通过抑制肝脏从循环血液中摄取内脂素以维持低水平，减少内脂素在肝脏损伤和再生的负面效应[25]。这种负面效应主要是影响了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)的生物合成活力，而不是炎症反应。
另一项引人注目的实验发现，脂质代谢通路花生四烯酸12-脂氧合酶(archidonate 12-lipoxyhenase，ALOX12)-12-羟基二十碳四烯酸(12-hydroxyeicosatetraenoic acid，12-HETE)-G蛋白偶联受体31(G-protein coupled receptor 31，GPR31)对肝脏IRI引起的固有免疫反应也至关重要[26]。肝细胞缺血缺氧条件下，ALOX12显著促进12-HETE生成，促进12-HETE与GPR31结合，激活炎症反应，加重肝脏损伤，阻断12-HETE生成也可以减轻肝脏IRI引起的肝脏功能障碍、炎症反应和细胞坏死。
在再灌注阶段，伴随着LSEC的功能失调，肝Kupffer细胞大量激活，促进坏死的肝细胞释放DAMPs。TLR识别DAMPs，导致下游炎症反应的级联效应。实验证实，在冷保存和移植期间TLR4的增加与肝细胞损伤呈正相关[27]。已有研究报道20多种TLR2和TLR4配体(包括细胞内蛋白、细胞外蛋白、氧化修饰蛋白和其他可溶性蛋白)参与肝脏IRI[28]。HMGB1被认为是内源性TLR4配体介导激活肝脏IRI固有免疫反应的关键分子[15]。缺血缺氧条件下肝细胞释放HMGB1，依赖于TLR4机制可产生ROS，反之ROS又可通过Ca2＋-K＋泵诱导HMGB1释放；该环路可能是导致肝脏IRI持续进展的原因[29]。低氧下TLR4介导的干扰素控制因子1(interferon regulatory factor-1，IRF-1)上调是肝细胞释放HMGB1的必要条件[30]。HMGB1依赖于晚期糖基化终产物受体和TLR4也能将炎症细胞招募于损伤组织[31]。此外，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like recepter protein 3，NLRP3)为核苷酸结合寡聚化结构域家族成员招募于多核细胞中，对肝细胞损伤起到重要作用[32]。基因沉默NLRP3能减轻肝脏损伤，降低促炎因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)和HMGB1水平，减少局部炎症细胞浸润[33]。
有学者认为自噬和KLF2共享一个途径激活肝脏内皮功能，能够互相调节[34]。自噬是真核生物细胞内普遍存在的生命现象，参与多种肝脏损伤和保护机制[35]。在短暂的缺氧或饥饿条件下，细胞自噬会被激活，确保细胞生存和限制细胞凋亡。实验发现大鼠肝脏在冷保存期间，肝脏自噬功能下调与肝脏损伤呈正相关[36]，而增强自噬可减轻肝细胞凋亡[37]。
他汀类药物是有效的KLF2活化剂，依赖于香叶酰香叶酰化焦磷酸通路。Guixé-Muntet等[37]深入研究发现冷保存且无再灌注条件下，LSEC并没有明显改变，但经过再灌注后细胞凋亡会增加；肝脏在冷保存液(UW液)中保存后、再灌注时，LSEC中会出现大量自噬体积聚，以溶酶体介导的自噬流发生紊乱；辛伐他汀能上调Rab7通路激活自噬流，诱导KLF2表达，改善LSEC活力，减轻其损伤。本中心前期实验证明在缺血前30 min对大鼠应用辛伐他汀腹腔注射预处理能够促进KLF2表达增加[13]，随之内皮素-1含量增加能改善内皮细胞功能，降低肝脏血管阻力，进而减轻肝脏损伤；增加eNOS、Nrf2表达，减少细胞凋亡，抑制炎症反应，减轻氧化应激反应，从而缓解IRI。
微小RNA(miRNA，miR)是一种小分子非编码单链RNAs，参与控制细胞多种功能，包括组织损伤和修复。一项临床试验报道肝移植术后受者血浆中肝脏相关miR(miR-122、miR-148a和miR-194)升高与肝酶水平呈正相关[38]。因此，miR可能成为减轻肝脏IRI靶点。肝移植术后IRF-1介导的炎症反应涉及多个方面，包括产生炎症介质、激活凋亡通路和MAPK通路[39]；在冷保存阶段对抗或沉默IRF-1能减轻肝脏IRI[40]。最近研究发现，B7-H1作为B7家族成员可以控制细胞介导的免疫反应，在小鼠冷保存肝移植模型中上调B7-H1能改善肝脏IRI，而抑制B7-H1则增加CD8＋ T细胞浸润，导致肝脏功能恶化[41]。
肝脏IRI已被证实包括分子水平和细胞水肝损伤，参与肝脏IRI的分子机制复杂多样。不同的缺血类型涉及不同的细胞和信号通路，固有免疫反应起到至关重要的作用。干扰相关的损伤机制可能是未来临床改善肝脏IRI的新方向。
