自1927年被发现有生物效应以来，超声在医学领域中的应用已接近1个世纪。不同于依靠热效应用于组织消融的高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)，低强度脉冲超声(low intensity pulsed ultrasound，LIPUS)主要通过非热效应(机械效应和空化效应)实现无创调控。凭借其分辨率高和穿透性强的优点，LIPUS在神经调控领域中发挥了重要的作用，已被证实在促进神经信息传递、增强大脑功能、减轻记忆损伤等方面均有积极效应，具有可观的应用前景。LIPUS的参数涉及频率、占空比、脉冲重复频率、持续时间等，而这些参数对LIPUS作用效果的影响尚不明确。本文从上述参数角度入手，对LIPUS进行系统性的概括和总结，并对近年来LIPUS在神经调控方面的进展进行综述，旨在为精准化治疗和调控提供有力参考，为LIPUS的临床应用提供思路。
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低强度脉冲超声(low intensity pulsed ultrasound，LIPUS)，一般指有效声强小于3W/cm2，并以脉冲形式输出的超声波[1]。相较于高强度聚焦超声(high intensity focused ultrasound，HIFU)，LIPUS具有对组织无损伤、分辨率高的优点，主要依靠非热效应发挥功效。LIPUS的主要参数从不同的角度影响超声结构，进而影响其作用效果。自1929年Harvey首次发现超声的神经调控效应以来，LIPUS已被证实在激活神经元、促进神经再生、改善行为和认知等方面都发挥着重要作用[2,3,4]。本文首先对LIPUS相关参数进行介绍，随后对LIPUS在神经调控领域的应用现状进行综述。
LIPUS主要由两层超声脉冲组成，内层基本组成为单个正弦波，多个正弦波连续重复出现组成单个超声脉冲；多个内层超声脉冲以一定的频率重复组成外层超声脉冲，外层超声脉冲再以一定的频率重复，形成整个超声脉冲刺激[5]。
与LIPUS效应有关的主要参数为声强(acoustic intensity，AI)，其次，影响超声作用效果的参数还包括：基波频率(fundamental frequency，FF)、脉冲重复频率(pulse repetition frequency，PRF)、声波持续时间(sonication duration，SD)和占空比(duty cycle，DC)，以上各参数间的关系见图1。
注：FF，基波频率；SD，声波持续时间；PRF，脉冲重复频率；M，脉冲个数；DC，占空比；Al，声强；PRT，脉冲重复时间。
FF是指组成超声的内层正弦波的频率，超声波的FF在20kHz以上，FF决定了LIPUS的应用对象。FF越高，超声的穿透力减弱，分辨率越高，医学中常用的诊断超声，频率多在2.5MHz以上[6]。低频超声具有较强的穿透力，研究表明0.5~1MHz可有效穿透颅骨[7]，为脑调控提供了可能。
PRF是单位时间内超声脉冲的重复次数，有时也直接使用其倒数脉冲重复时间(pulse repetition time，PRT)，即超声脉冲的周期。有研究报道引起神经元兴奋的最小PRF为10Hz[8]，神经调控领域PRF多集中在1kHz。不同类型的神经细胞对不同PRF的超声刺激反应不同，因此可通过改变PRF实现对特定类型细胞的靶向调控[9]。
DC是单个脉冲重复周期中超声持续时间所占的比重，影响超声的积累效应。针对LIPUS双层脉冲的特征，DC也有两个具体的指标：爆发占空比(burst duty cycle，BDC)和试验占空比(trial duty cycle，TDC)，分别表示内层和外层中超声脉冲时间的比重。有些研究中仅使用内层脉冲，此时DC即爆发占空比。神经调控中DC多在50%以下[10,11]。
SD指内层超声的总持续时间，由脉冲个数和脉冲重复频率共同决定。有研究表明较长的SD可以引发更加显著的γ脑节律(30~45Hz)能量增加[12]，但SD对超声调控效果的影响仍需要进一步的探究。
AI作为LIPUS的重要参数，除了影响调控效果外，也是评估安全性的重要指标。超声强度的表示方法有多种，常用的AI参数包括声压，空间峰值脉冲平均声强(intensity of spatial-peak pulse-averaged intensity，ISPPA)，空间峰值时间平均声强(intensity of spatial-peak temporal-averaged intensity，ISPTA)等。人们对超声安全性的考量主要来自其热效应和力学效应，因此为了评价超声的安全性，又引入了两个指标：热指数(thermal index，TI)和机械指数(mechanism index，MI)。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)对超声安全的要求如表1[13]。
美国食品药品监督管理局对诊断超声设备输出最大限制
美国食品药品监督管理局对诊断超声设备输出最大限制
| 超声照射部位 | 空间峰值时间平均声强(mW/cm2) | 空间峰值脉冲平均声强(W/cm2) | 机械指数 |
|---|---|---|---|
| 外周血管 | 720 | 190 | 1.9 |
| 心脏 | 430 | 190 | 1.9 |
| 胎儿及其他 | 94 | 190 | 1.9 |
| 眼科 | 17 | 28 | 0.23 |
注："胎儿及其他"包括腹部、术中、儿科、小器官(乳房、甲状腺、睾丸等)及新生儿和成人头部。
在离体实验中，Tyler等[14]发现LIPUS可以通过激活电压门控钠通道和钙通道激活神经元，促进海马回路中可溶性N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide-sensitive factor，NSF)附着蛋白受体蛋白介导的胞吐作用和突触传递。Huang等[15]使用FF 0.68MHz，PRF 500Hz的LIPUS刺激原代神经元后，发现自噬标志物微管相关蛋白轻链3B的表达增加，神经元自噬被激活，且这种效果随着刺激时间和AI的增加而增强。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一种参与中枢神经系统神经发生和突触可塑性的神经营养因子，可影响神经元发育，保护应激诱导的损伤，参与多种精神疾病的病理生理过程。FF 1MHz，AI 69.3mW/cm2的LIPUS可促进神经干细胞增殖和包含BDNF在内的多种营养因子的分泌，而不影响细胞凋亡[16]。离体小胶质细胞模型上，LIPUS处理可显著提高BDNF水平，抑制促炎因子表达和小胶质细胞凋亡，从而减轻脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的炎症反应[17]。小鼠脑片实验则显示，LIPUS可增强神经元中钙信号的传递，而这种神经元反应依赖于PRF[18]。除促进细胞增殖和信息传递外，LIPUS也会影响神经细胞的形态学变化。Ventre等[19]使用超声刺激与施万细胞共培养的背根神经节神经元，发现低强度和中强度的超声持续增加了生长量及轴突数量，高强度超声结果则相反。这提示AI是超声促进神经修复中的关键参数。
特定频率的LIPUS可完整穿透颅骨并将能量输送到目标区域，因而可实现对大脑特定区域的精准调控。
脑电图(electroencephalogram，EEG)是一种可在亚秒级时间范围内测量神经元活动的技术，是评估脑功能的重要工具[20]。LIPUS对脑电信号的影响与PRF密切相关。Park等[21]将脉冲重复频率40Hz的LIPUS应用于小鼠大脑，时频图结果显示超声成功诱发了以40Hz为中心的频段内脑电反应。而为期两周的超声治疗后，阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)小鼠脑电中自发γ节律能量和相位-幅值耦合均有所增加，表明了LIPUS对脑功能的改善。PRF高于100Hz的脉冲超声，可在大鼠视觉皮质诱发持续20ms的低频电位响应，而这种响应在正常和视网膜退化失明大鼠中均可获得，且失明大鼠的响应效果更好，说明LIPUS在失明治疗方面也具有一定潜力[22]。Liu等[23]在既往低强度经颅超声刺激的研究基础上，通过显著减少内层脉冲个数，实现了一种极低强度经颅超声刺激，并将其施加于枕叶，结果发现不同的PRF会导致不同的大鼠脑节律成分变化：500Hz和1kHz的PRF可使脑电信号中高频段的γ节律兴奋，而1.5kHz的PRF可激活低频的δ和θ节律，与大脑的认知和学习有密切关系。同时，脑血流动力学方面的研究表明，健康小鼠皮质血流量峰值会随着LIPUS的SD和ISPPA的增加而增加[24]。
超声对大脑的调控效果与刺激靶点密切相关。Kubanek等[25]使用持续时间300ms的LIPUS刺激猕猴大脑额叶视区，影响了正常猕猴对目标的选择，但刺激运动皮质LIPUS却没有得到相同的结果，证明了LIPUS神经调控的空间特异性[26]。内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex，mPFC)的兴奋性神经元会对社会刺激作出反应，Niu等[27]将LIPUS应用于mPFC，发现超声显著增强了该区域内社会活动相关的神经元激活，并有效减少了小鼠的社交回避行为。针对脑深部区伏隔核的LIPUS刺激可诱发小鼠的行为回避，抑制吗啡诱导的条件位置偏好，暗示其可用于调控成瘾行为。Bian等[28]发现对腹侧被盖区的超声刺激可特异性降低小鼠对异氟烷麻醉的敏感性，延长麻醉诱导时间，同时缩短麻醉后的苏醒时间。而使用FF 1MHz，DC 10%，声压0.13MPa的超声靶向刺激老年小鼠下丘脑腹内侧核后，衰老小鼠的活动能力和认知水平得到改善，细胞凋亡因子和炎症因子水平降低，说明LIPUS可能具有延缓衰老的潜力[29]。
在脑损伤动物模型上，Huang等[30]使用1MHz，DC 5%，AI 528mW/cm2的超声治疗永久性双侧颈动脉闭塞大鼠，结果表明LIPUS能够抑制双侧颈动脉闭塞导致的BDNF减少，减轻神经元损伤和神经纤维的脱髓鞘；LIPUS同时还减轻了胼胝体白质的病变，有效减轻了脑灌注不足引起的记忆损伤。上述结果表明LIPUS对中枢受损神经元具有一定的修复作用，可用于血管性痴呆的治疗。此外，LIPUS也可通过抑制Toll样受体4/核转录因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路和增强BDNF表达来减轻慢性神经炎症所导致的记忆损伤[31]。皮质扩布性抑制(cortical spreading depression，CSD)是一种神经元与神经胶质去极化的扩散波，与多种神经功能障碍相关。FF 1MHz，PRF 1kHz的LIPUS刺激CSD大鼠30min可以有效抑制CSD的传播速度，改善CSD大鼠的运动，且这种效果与超声强度相关呈正向[32]。对慢性应激大鼠mPFC进行4周LIPUS刺激，可有效改善大鼠抑郁样行为，其机制可能与BDNF/细胞外信号调节激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号通路的活化有关[33]。在帕金森小鼠模型中，LIPUS可促进多巴胺的释放，并使帕金森小鼠的运动恢复到正常水平，为无创治疗帕金森病提供了方案[34]。在癫痫研究上，Chen等[35]使用LIPUS刺激急性癫痫大鼠，发现LIPUS抑制了戊四唑诱导的磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶点信号通路。这可能是超声调控癫痫发作的一种机制。研究者也对超声参数在癫痫调控中的作用进行了探讨，发现MI是抑制癫痫样放电的关键因素，其他参数为支持因素，但DC在此过程中没有表现出明显的影响关系。
LIPUS可通过刺激外周器官，激活相应神经通路实现神经调控，在调节代谢障碍、改善炎症等方面显示出积极的作用。肝脏超声刺激可通过调节相应神经通路实现血糖调节；分子和神经影像学显示超声可诱导信号传导至代谢相关的下丘脑核团，为研究外周器官刺激对中枢神经的影响提供了思路[36]。随后，同一课题组还指出了肝门超声刺激可减轻肥胖引起的代谢障碍和炎症反应，在治疗小鼠肥胖和相关并发症中具有一定功效[37]。以脾脏为作用靶点的研究中，现有文献主要围绕胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)探究LIPUS的抗炎效应。Zachs等[38]发现FF为1MHz，声压为350kPa的脾脏超声可以有效减轻小鼠关节炎，改善临床评分，且这种抗炎效应具有脾脏特异性。同样是脾脏超声，Cotero等[36]结果表明1min的超声降低了脾脏和外周血中的炎症因子水平，抑制了LPS诱导的急性炎症反应，其机制可能与CAP激活有关。而腹部LIPUS可通过激活CAP，在减少CD8+和CD25+T细胞的同时增加CD4+T细胞和B220+细胞，从而减轻右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎[39]。同时，在脓毒症大鼠模型上也观察到，超声通过对CAP的激活，抑制感染性休克期间的炎症反应，延长大鼠的存活时间[40]。
Lipsman等[41]结合功能性磁共振成像技术(functional magnetic resonance imaging，fMRI)，将聚焦超声应用于AD患者的右侧前额叶，首次证明了超声可安全开放人体血脑屏障。在对64例低强度经颅超声人体试验的参与者的问卷调查显示，超声刺激在后续特征和症状发生率上与其他无创脑调控技术相同，再次证实超声临床治疗的安全性[42]。一项随机双盲研究中，被500kHz超声靶向刺激右额下回30s后，参与者的情绪量表评分有所提升，情绪发生了积极的转变，表明超声可用于调节情绪[43]。Legon等[44]使用FF 0.5MHz，PRF 1kHz的超声刺激大脑初级感觉皮质，发现在不影响反应偏差和任务注意力的情况下，超声增强了受试者的体感识别能力，这一发现说明超声可以局部调节人类感觉诱发的大脑活动和皮质功能。Fomenko等[45]将LIPUS作用于受试者的运动皮质，发现超声可以安全地抑制经颅磁刺激诱发的运动皮质活动，且声波持续时间更长，DC更短时，这种效果更佳。这些结果都展现了超声作为一种无创神经调节策略的可能性。Beisteiner等[46]开展了一项超声刺激临床研究，收集了35例AD患者的临床试验数据。结果显示，超声治疗后，神经心理学评分显著改善，效果长达3个月。而fMRI数据显示大脑中记忆网络(海马、海马旁皮质、顶叶皮质和楔前叶)的功能连接增强，且功能连接值的增加与神经心理学评分显著相关，记忆网络的功能连接上调与认知能力的增加有关。随后Popescu等[47]对17例AD患者开展了为期2~4周的超声刺激，观察到类似的认知改善效应，同时发现刺激后受试者AD相关脑区皮质厚度增加，提示超声可能是通过减少皮质萎缩发挥作用。此外，Cain等[48]在意识障碍患者中开展了首次人体临床试验，患者在接受丘脑超声刺激后，神经行为评分均有改善，揭示LIPUS在意识障碍治疗方面的潜力。一项针对健康人的脉冲超声脑调控研究显示，靶向初级躯体感觉皮质的脉冲超声增加了功能耦合，并改善了刺激后1周感觉运动网络中的白质结构完整性，提示超声诱导的神经可塑性变化可能是一种长期效应[49]。目前而言，LIPUS的临床应用靶点主要集中在皮质，同时需要通过结合fMRI、EEG等其他成像技术来辅助评估效果。
目前各研究中使用的参数不尽相同，而对超声参数的探索也主要集中于AI，其他参数如何影响调控效果未有定论。LIPUS在神经系统中的应用大部分仍局限于基础研究，部分临床有益探索验证了其安全性，并在AD的初步临床研究中展现出应用于神经疾病治疗的潜力。而将LIPUS与其他实时检测技术(如fMRI、EEG等)相结合，可实现超声调控效果的实时评估，有利于超声调控机制的深入探索，有望推动临床神经调控新技术发展。随着研究的不断深入，LIPUS这种分辨率高且安全的治疗手段正逐步地应用于临床实践。而伴随调控机理的揭示及应用参数的明确，LIPUS在神经科学领域将会有广阔的应用前景。
