酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是常见的肝脏疾病之一，肠道微生态在ALD的发病机制中起着十分重要的作用，酒精的摄入会导致肠道微生态的紊乱、肠道屏障的破坏及菌群的移位，进而导致肝脏炎症的出现。深入探究肠道微生态在ALD发生中的作用机制有助于寻找新的治疗靶点。本文就近年来ALD相关肠道微生态研究进展进行综述，从而有助于探索ALD新的诊治手段。
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酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是全球范围内常见的肝脏疾病之一，临床上可表现为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)、酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化[1]。ALD严重影响人类健康，2019年全球约25%的肝硬化相关死亡与饮酒有关[2]。ALD具有较高癌变风险，酒精性肝硬化患者10年的肝细胞癌累积风险为9%[3]。探究酒精导致肝脏病变的具体机制，寻找有效的治疗靶点是目前亟待解决的临床问题。
肠道微生态由肠道微生物及其所生活的环境共同构成，微生物包含了细菌、真菌、病毒、古生菌等。多种疾病如精神疾病、心血管疾病、代谢性疾病、炎症性肠病及肿瘤等都与肠道微生态的失衡有关[4]，肠道微生态在ALD的发生发展中同样起到了重要作用，本文就ALD与肠道微生态的研究进展进行综述。
酒精在多个相互关联的水平上破坏肠-肝轴，包括肠道微生物群、黏液上皮屏障和抗菌肽的产生等，从而增加微生物暴露，导致肠道菌群移位，内毒素通过门静脉抵达肝脏，加重肝脏炎症[5]。在酒精性肝损伤的早期阶段，肝脏具备有效清除内毒素的能力，随着酒精的持续摄入会使肠道对内毒素的通透性不断增加。长期饮酒导致肠道屏障破坏更加严重，肠道微生物的病原体相关分子模式包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和其他细菌产物[6]，通过门静脉进入肝脏。此外，酒精、酒精代谢物及酒精代谢过程中产生的活性氧会导致肝细胞氧化应激，释放损伤相关分子模式。肠源性病原体相关分子模式和肝细胞源性损伤相关分子模式通过结合模式识别受体如Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)，促进促炎细胞因子的表达和释放，导致肝细胞损伤[7]。近期研究发现肠道来源的高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)以HDL3亚种的形式，在门静脉中通过脂多糖结合蛋白与LPS结合，LPS核心结合区被掩盖，无法与肝脏库普弗细胞的TLR4结合，阻止了肝脏炎症激活。此外，HDL3结合的LPS会被酰基羧酸水解酶脱酰失活，保护了肝脏免受肠源性内毒素的损伤[8]。
即便只是摄入极少量的酒精，也可以导致肠道屏障的损害及内毒素生物活性的增强[9]。肠上皮细胞的再生是应对肠道上皮损伤动态平衡的重要因素，肠道干细胞通过不断地增殖与分化使肠道上皮得以更新，饮酒会通过Wnt信号通路刺激小肠上皮细胞的增殖[10]。动物模型发现，酒精可以导致肠道干细胞损伤，这可能是酒精致使肠道屏障损伤的机制之一[11]。近年来在小鼠和人类中发现了一种肠道血管屏障(gut-vascular barrier，GVB)，可以阻止微生物进入门静脉循环。GVB受损伴随着质膜囊泡相关蛋白-1(plasmalemma vesicle-associated protein-1，PV1)水平的增加[12]。ALD小鼠模型PV1的表达增加，通过给予ALD小鼠模型补充嗜黏蛋白阿克曼菌(A.muciniphila)可以降低PV1的表达，恢复GVB[13]。
酒精会对肠道的免疫屏障、免疫细胞造成影响。一项研究中与对照组或非酒精性脂肪肝患者相比，ALD患者十二指肠CD8+驻留记忆T(T resident memory，TRM)细胞数量减少[14]。肠道中CD8+TRM淋巴细胞可以防止微生物的附着、入侵及移位，ALD患者中血清微生物移位标志物水平升高与CD8+T细胞数及TRM比例呈负相关。十二指肠CD8+TRM细胞的死亡及免疫功能改变可能有助于减少对微生物的免疫监视，从而促进微生物移位。短期戒酒并不能逆转ALD患者的TRM细胞死亡，在ALD中十二指肠CD8+TRM细胞凋亡表明肠道适应性免疫功能受损[14]。
抗菌肽是肠-肝轴中的重要组成部分，长期饮酒会抑制抗菌肽再生胰岛衍生蛋白3β(regenerating islet-derived protein 3-beta，REG3B)和再生胰岛衍生蛋白3γ(regenerating islet-derived protein 3-gamma，REG3G)的表达，导致肠道黏膜表面的细菌黏附增加，肠道细菌过度生长，细菌移位增加，加重肝脏炎症。Reg3g－/－和Reg3b－/－酒精暴露小鼠肠道黏膜细菌数量增加，并且细菌向肠系膜淋巴结和肝脏的移位增加，促进了ALD的进展。在肠上皮细胞中过表达REG3G可以限制细菌在黏膜表面的定植，减少细菌移位，保护小鼠免受ALD的影响[15]。在ALD小鼠模型中吲哚-3-乙酸水平下降，激活了芳香烃受体，减少了肠道中白细胞介素-22(interleukin 22，IL-22)的表达，导致REG3G的表达减少，从而导致细菌移位到肝脏[16]。此外，人β防御素-2(human beta defensin-2，HBD-2)是一种抗菌肽，酒精暴露小鼠口服HBD-2，可以通过诱导IL-17A和IL-22，增加肠道和肠系膜淋巴结中T调节细胞的丰度，改变肠道菌群的组成改善小鼠ALD[17]。
饮酒会导致肠道细菌多样性减少和微生物群组成的变化[18]。酒精对于肠道菌群的影响是动态改变的，随着酒精摄入时间的延长，肠道菌群在丰度和种类上会不断变化。Posteraro等[19]分别给予大鼠连续3个月、6个月及12个月的乙醇喂养，发现在3个时期大鼠粪便中的优势菌群并不完全相同。此外，在健康对照组、重度饮酒对照组及AH患者的粪便菌群间存在显著差异，与健康对照组相比，重度饮酒对照组粪便中拟杆菌门(Bacteroidetes)明显减少。与重度饮酒对照组相比，AH患者在瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)等菌的丰度上具有显著差异[20]。不同严重程度的AH患者间肠道菌群也存在差异。Lang等[21]对AH患者的粪便样本进行了16S rRNA测序，发现病情较重的AH患者阿克曼菌(Akkermansia)相对丰度显著降低，韦氏杆菌(Veillonella)相对丰度显著升高。此外，在小鼠模型中发现长期摄入酒精会导致普雷沃氏菌(Prevotella)在回肠黏液层及肝脏中的数量增加，表明饮酒也会造成菌群移位到肝脏[22]。
近期研究发现肠球菌属(Enterococcus)中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)在ALD的发病中发挥了作用。生理情况下胃酸会杀死摄入的微生物，抑制胃酸分泌会改变肠道微生物的组成。Llorente等[23]应用Atp4aS1/S1小鼠(质子泵编码基因敲除小鼠)进行实验，Atp4aS1/S1小鼠与对照组小鼠酒精暴露后，Atp4aS1/S1小鼠出现了更严重的肝脏损伤，说明胃酸的缺失促进了ALD疾病的进展。对两组小鼠的粪便进行16S rRNA测序发现Atp4aS1/S1小鼠中肠球菌比例明显增加，粪肠球菌占据最高的比例。Atp4aS1/Sl小鼠酒精暴露后，肠系膜淋巴结和肝组织中肠源性肠球菌的数量显著高于对照组，表明肠球菌不仅在肠道中显著增加，并且移位到肠系膜淋巴结及肝脏。随后给予小鼠静脉注射质子泵抑制剂来模拟Atp4aS1/S1小鼠的胃酸缺乏，质子泵抑制剂注射小鼠比对照组出现了更严重的乙醇诱导的肝脏病变，粪便中肠球菌数量显著增加，肠系膜淋巴结和肝脏也出现了肠球菌的移位。应用分离出的粪肠球菌反复灌胃野生型小鼠，诱导粪肠球菌生长，发现其加剧了乙醇诱导的小鼠肝脏病变，表明肠球菌促进了小鼠肝病的进展。该团队进一步深入探究发现肝脏库普弗细胞可以识别肠球菌并诱导IL-1β的分泌，从而导致肝脏炎症和肝细胞损伤。该项研究表明胃酸缺乏的情况下，摄入酒精会促进ALD的发生。
Duan等[24]发现与对照组相比，AH患者粪便中粪肠球菌数量增加，粪肠球菌分泌的一种外毒素溶细胞素(cytolysin)与AH患者预后相关，89%的溶细胞素阳性AH患者在入院后180d内死亡，而溶细胞素阴性患者只有3.8%的死亡率。其团队还发现乙醇诱导的肠道屏障变化是溶细胞素粪肠球菌从肠道转移到肝脏所必需的，但溶细胞素本身并不会影响肠道屏障功能。一项调查中，96例名非酒精性脂肪肝病患者中只有7例患者溶细胞素呈阳性，与溶细胞素阴性患者相比，这些患者肝脏疾病的活动性并无显著差异。溶细胞素有助于预测AH患者预后，是潜在的生物标志物[25]。此外，通过检测粪肠球菌壳多糖血清抗体来评估粪肠球菌移位，也可以预测ALD的预后[26]。
Duan等[27]进一步深入探究发现ALD患者的肝脏组织中免疫球蛋白超家族补体受体(complement receptor of immunoglobulin superfamily，CRIg)减少，CRIg在库普弗细胞上表达，可以与补体成分C3b或革兰氏阳性菌结合，介导吞噬功能。与对照组相比，CRIg－/－小鼠酒精暴露后肝脏损伤更加严重，CRIg－/－小鼠在清除革兰氏阳性细菌(如从肠道转移到肝脏的粪肠球菌)的能力弱于对照组，该研究表明乙醇通过降低肝脏CRIg的表达减弱肝脏清除病原体的能力，从而促进ALD的进展。
近期的研究也发现了一些对于ALD具有治疗前景的"有益菌"。Seo等[28]发现罗氏菌属(Roseburia)的减少与饮酒相关。给予ALD小鼠模型罗氏菌属治疗，发现其鞭毛蛋白可以通过识别TLR5上调肠道紧密连接蛋白恢复肠道屏障的完整性，并通过上调IL-22和REG3G的表达恢复肠道微生态。此外，多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)是人和小鼠肠道微生态中的重要成员，在新陈代谢、肠道免疫和黏膜屏障等方面发挥着重要作用。口服多形拟杆菌可以改善ALD动物模型的肝脏损伤[29]。这些"有益菌"的发现，为未来治疗ALD的益生菌药物研发提供了新的思路。
肠道中的真菌丰度远低于细菌丰度[30]，近年来随着测序等技术的不断发展，真菌作为肠道微生态中的基本组成部分引起了人们的重视。真菌感染在重症肝病中较为常见，比如侵袭性曲霉菌感染是重型酒精性肝炎(severe alcoholic hepatitis，SAH)的常见并发症，具有极高的死亡率[31]。
酒精可以影响肠道内的真菌变化，对酒精使用障碍者(alcohol use disorder，AUD)和健康对照者进行比较，发现AUD中念珠菌属(Candida)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、白念珠菌属(Candida albicans)、涎沫念珠菌(Candida zeylanoides)丰度均显著高于对照组[32]。研究发现AH患者的血清抗酿酒酵母抗体(anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies，ASCA)水平显著高于AUD和对照组，血清ASCA的升高与AH患者死亡率增加相关，可用于预测AH患者的预后[33]。
肠道真菌可能从以下方面发挥作用：一方面肝脏库普弗细胞的C型凝集素结构域家族7成员A(C-type lectin domain family 7 member A，CLEC7A)可以与真菌的细胞壁成分β-葡聚糖结合，释放IL-1β，从而促进小鼠肝脏炎症[34]。白念珠菌分泌的念珠菌素可以破坏肠上皮，激活宿主免疫反应[35]。AH患者白念珠菌数量增加，编码念珠菌素的细胞延伸程度1(extent of cell elongation 1，ECE1)基因的表达也显著增加。念珠菌素并不影响肠道通透性，也不与CLEC7A相互作用，其通过增加小鼠肝脏中IL-1β及趋化因子的表达，从而促进免疫细胞的募集和诱导肝细胞死亡[36]。此外，念珠菌素在体外以剂量依赖的方式损伤原代肝细胞，并与AH患者的肝病严重程度和死亡率有关[37]。另一方面，近期一项研究发现ALD小鼠粪便中的季也蒙念珠菌(Meyerozyma guilliermondii)及前列腺素E2显著增加。在无真菌小鼠体内接种季也蒙念珠菌后，其通过花生四烯酸的生物转化产生前列腺素E2加重ALD[38]。
人类肠道中含有大量的病毒，其中大部分是噬菌体[39]。目前关于肠道病毒对人类健康和疾病的了解很少。Jiang等[40]发现ALD患者粪便样本中病毒的多样性增加，AH患者变化最显著。在AH患者的粪便样本中，大肠杆菌噬菌体(Escherichia phages)、肠杆菌噬菌体(Enterobacteria phages)和肠球菌噬菌体(Enterococcus phages)的比例升高，细小病毒科(Parvoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)等病毒的数量也显著增加。其中葡萄球菌噬菌体(Staphylococcus phages)和疱疹病毒科与疾病严重程度增加及90d死亡率的增加相关。
给予AH患者鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)R0011和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)R0052进行治疗，发现相较对照组，益生菌组的患者内毒素水平显著下降，肝功能分级改善，转氨酶下降，鼠李糖乳杆菌R0011和瑞士乳杆菌R0052可能通过恢复AH患者肠道微生物群，调节肠-肝轴而改善AH[41]。目前针对ALD的益生菌治疗尚需要进一步验证。
利福昔明在临床上广泛应用，被认为可以改善肠道屏障功能障碍，用于防治肝性脑病。Fujimoto等[42]给予酒精性肝硬化小鼠模型醋酸锌联合利福昔明治疗，发现该治疗方式可以通过维持肠道屏障的完整性来预防肝纤维化进展。也有研究发现在酒精暴露的小鼠中给予抗真菌药物可以减少肠道真菌的过度生长，并改善乙醇诱导的肝病[34,38]。
对于SAH患者，粪便菌群移植(fecal microbiotatransplantation，FMT)可能是一个潜在的治疗措施[43]。Philips等[44]于2017年报道了1例FMT治疗激素无效的SAH患者，治疗后该患者病情明显改善。对于激素治疗无效的SAH，FMT治疗或许可以成为在等待肝移植期间备选的治疗方式。Sharma等[45]对SAH肝衰竭患者进行单次FMT治疗，结果发现FMT组28d和90d的生存率明显高于对照组，FMT组肝性脑病及腹水缓解率为100%。自发性细菌性腹膜炎、消化道出血等主要不良事件发生率在两组中无明显差别。该研究认为FMT治疗SAH肝衰竭是安全有效的，可以改善SAH肝衰竭患者的生存率，并改善临床严重程度评分。此外，在一项临床试验中，FMT治疗可以在短期内减少酒精性肝硬化患者酒精渴望和饮酒[46]。给予无菌小鼠酒精性肝硬化患者在FMT前后的粪便或无菌上清液灌胃，发现使用FMT后的粪便灌胃小鼠减少了酒精的摄入，降低了对于酒精的偏好[47]。
ALD对人类健康造成了负担，明确ALD中肠道微生态的改变及其机制具有十分重要的意义，也有助于寻找潜在的治疗靶点，是目前研究的热点之一。目前虽然已取得很大进展，但仍有许多未知之处。在常规治疗的基础上，ALD基于肠道微生态失衡的治疗方法具有一定的前景，但还需要进一步深入研究及大样本的临床试验验证。
