布鲁氏菌（Brucella）是一种革兰阴性杆菌，容易感染猪、牛、羊等家禽，布鲁氏菌病通过直接接触受感染的动物、割伤和擦伤、吸入气溶胶或摄入未经巴氏消毒的牛奶或奶制品传染给人类。布鲁氏菌病在地中海盆地、中东和拉丁美洲最为流行，在全球范围内，每年诊断出50万例新增布鲁氏菌病例，代表着世界上最流行的细菌性人畜共患病^{[1, 2]} 。然而，由于诊断不准确、监测不充分，许多病例仍未被识别，在不完整的报告中，这个惊人的数字只能被认为是最小的估计。根据世界卫生组织(WHO)的数据，实际发病率可能至少高出一个数量级。全球牲畜的疾病负担甚至更大，保守估计全球14亿牛中有3亿牛感染了这种病原体^[3] 。目前陆生布鲁氏菌属包括6个种：马耳他布鲁氏菌、流产布鲁士菌、猪布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、绵阳布鲁氏菌和沙林鼠布鲁氏菌。由布鲁氏菌感染所致的布鲁氏菌病(brucellosis)是一种人畜共患病，其临床特点为长期反复发热(地中海弛张热，马耳他热或波浪热)、多汗、关节痛及肝脾肿大等症状，易侵犯中枢神经系统和脊柱^[4] 。中枢神经系统受累的布鲁氏菌病被称为神经型布鲁氏菌病（Neurobrucellosis NB），是由布鲁氏菌侵犯中枢神经系统引起的人畜共患病^{[5, 6]} 。主要累及脑脊髓膜及半卵圆，临床相对少见（发病率低于5%）^[7] 。NB可在疾病的任何阶段发展，可能有广泛的不同的表现，包括脑炎、脑膜脑炎、神经根炎、脊髓炎、周围神经和颅神经病变、蛛网膜下腔出血和精神症状^{[8, 9]} ，NB患者既没有典型的临床表现，也没有特定的脑脊液表现。NB的临床诊断无特异性，实验室检查无特征性指标，该病很容易与其他疾病混淆。目前国内外对儿童NB的报道较少，NB的治疗在临床多选用多西环素联合其他药物的治疗方案，与其他儿童化脓性脑炎的治疗方案多经验性选择头孢曲松或美罗培南完全不一致，因此尽早确诊NB有助于及时规范治疗减少后遗症的发生，而且对公共卫生也具有重大意义。本文通过对儿童中枢神经系统布鲁氏菌感染患者的临床和脑脊液宏基因组二代测序(metagenomic next generation sequencing, mNGS)结果进行分析，探索mNGS在儿童布鲁氏菌脑炎感染诊治中的临床应用价值。

中枢神经系统布鲁氏菌感染是布鲁氏菌感染机体后引起的一种少见的急危重症疾病，约占布鲁氏菌病患者的3%~5%^[7] ，NB于1896年由Hughes首次报道^[5] ，引其极易漏诊和误诊，极易造成临床的致残和致死，文献报道其病死率可高达7%^[12] ，无论布鲁氏菌从哪个入口进入人体，布鲁氏菌都会迅速通过上皮层易位，并被黏膜巨噬细胞和树突状细胞吞噬^[2] 。内化的布鲁氏菌最初定位于局部淋巴结，然后通过血液扩散。进入富含巨噬细胞的组织，如肝脏，脾脏，淋巴结，或骨髓。在那里，它们采取细胞内生活方式，逃避先天和适应性免疫反应和许多抗生素的作用^[13]，诱发持续感染。当机体宿主免疫力下降时，布鲁氏菌侵袭脑膜，通过受损的血脑-屏障侵犯中枢神经系统，引起各种神经系统症状^[14]。NB发病的具体机制目前仍不明确，有研究报道可能与细菌直接侵犯或其内毒素成分对神经系统产生影响有关^[15]。

NB临床上最常累及脑脊髓膜和中枢神经系统，以脑膜炎/脑膜脑炎、脊髓炎为主要临床表现^[16]，我院的这2例患者均有脑膜炎的症状，但是NB感染的临床表现与许多疾病都相似，不易区分。目前布氏菌的实验室检测主要有以下几种方法：(1)病原学检查：是布氏杆菌病的诊断"金标准"。但体外培养生长繁殖缓慢，检测周期长、阳性率低，常规脑脊液培养布鲁氏阳性报道极少^{[10, 17, 18]}。(2)血清学检查：血清学检测缺乏特异性，不能区分既往感染还是现症感染，容易出现假阳性和假阴性。(3)布鲁氏菌脑炎患者的脑脊液实验室检查指标与结核性脑膜炎相似，也缺乏特异性。(4)PCR技术及一代测序由于检测的序列有限，并受到仪器设备限制难于常规普及^[19]。

NB是一种可治性疾病，早期治疗效果良好，但是一旦误诊或漏诊，致残率很高，故需要探索新的临床诊断方法，帮助临床医师早期、灵敏、特异地诊断中枢神经系统布鲁氏菌感染。近年来mNGS以其病原诊断的高通量、快速精准的优势，能有效协助临床诊治NB。

本文通过对这2例患者的临床与mNGS结果分析，发现2例患者均有发热和脑膜刺激症。血常规中白细胞计数为（8.57~12.67）×10⁹/Ｌ，以中性粒细胞分叶核为主，单核细胞占比在16.70%~33.40%。脑脊液常规白细胞计数轻度升高（２8~33.3×10⁶/Ｌ），与血常规中细胞分类相反，以单核细胞为主（77.6%~92.9%），葡萄糖水平均降低（1.02~1.59 mmol/L），蛋白质水平均升高。患儿A血培养阴性，患儿B血培养培养5天为阳性。脑脊液普通培养为阴性。神经影像学和神经生理学评估，同时结合微生物学诊断工具有助于并发症的诊断和评估。磁共振成像可以显示实质性病变和神经受累，PET/CT常用于软脑膜受累的影像学检查^[20]。本研究影像学病灶多集中于双侧半卵圆中心等部位。2例患者的血清学布鲁氏菌凝集实验均为阳性，但血清学检测本身容易出现假阳性。2例患者均检测出布鲁氏菌序列，序列数分别为（175~389）条。2例患者临床表现、流行病学史、血清学布鲁氏菌凝集实验、脑脊液常规检查结果，若加上mNGS的分析结果，便能在早期证明该微生物感染的存在，故2例患者均被诊断为中枢神经系统布鲁氏菌感染。mNGS结果显示布鲁氏菌感染后我们实验室将先前普通培养保存的脑脊液1ml打入血培养瓶，增菌培养三天血培养仪报警，质谱鉴定均为羊布鲁氏菌，对于条件受限的实验室在高度怀疑布鲁氏菌感染时可先打入血培养瓶增菌，后再培养也能增加培养的阳性率。

mNGS采用宏基因组高通量测序技术基于对样本中病原微生物核酸序列进行分析，通过与数据库中已有微生物的核酸序列进行比对，鉴定样本中潜在存在的可疑12593种致病微生物，本研究中的mNGS可检测范围包括基因组序列已知的6039种细菌(其中包括174种分枝杆菌和137种支原体/衣原体/立克次体）、4945种病毒、1064种真菌和234种寄生虫。脑脊液mNGS通过对脑脊液标本中病原菌的DNA片段进行核酸序列进行测序分析，进而明确病原菌的属种，早期指导临床对感染性疾病的精准诊治，促进抗微生物药物的合理使用。mNGS技术对标本中存在微量的病原菌DNA即可被检出，对病原微生物的覆盖检出谱也是常规微生物技术难以企及的，且不受死菌的影响。通过mNGS我们还对分离到的2株菌株进行全基因组测序，经数据过滤和组装后获得基因组序列。将其与公共数据库下载的国内流行株和国际参比菌株进行比较，我们构建了系统进化树，证实该2例患者的脑脊液均为羊布鲁氏菌，且与2019年印度Veeraraghavan B等报到的CP044983.1株羊布鲁氏菌在进化系统中亲缘性最为相近，将mNGS引入临床领域将提高诊断水平。

虽然有越来越多的mNGS应用的成功报道，但仍有--些问题，如何区别感染与定植菌，识别外源性核酸污染，参照王辉教授牵头，我们实验室参与发表的《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》^[21]，聚力与标准化NGS检测过程，以及存储、分析和解读NGS数据结果^[22]。同时本研究存在样本量少，测序深度低等缺陷，后期会进一步扩大样本量和加大测序深度，从而为mNGS在中枢神经系统感染患者脑脊液中的应用提供灵敏性及特异性的评估，促进mNGS在儿童布鲁氏菌脑炎精准诊治中临床推广应用。