探讨FLT3-ITD突变数量、重排碱基长度和比例与急性髓系白血病（AML）患者的总体生存（OS）时间及持续完全缓解时间（CRD）的关系。
采用PCR-毛细管电泳法检测130例AML（除外M3）患者的FLT3-ITD突变。根据电泳峰型数量分为单或多个（片段）突变；FLT3-ITD突变比例为突变型峰面积/野生型和突变型峰面积之和；分析FLT3-ITD突变患者临床特征并随访患者预后。
FLT3-ITD多个突变常见于60岁以上患者；FLT3-ITD单个突变患者初诊骨髓原始细胞比例高于多个突变患者（0.758对0.638，P=0.028）；FLT3-ITD突变数量不影响患者预后。FLT3-ITD突变重排碱基长度亦对患者预后无明显影响。FLT3-ITD突变比例<10％患者的OS时间和CRD与同期C-KIT突变的中危组AML患者相似，均显著长于突变比例≥10％患者（中位OS时间分别为未达到、未达到、9.9个月，P<0.05；中位CRD分别为未达到、未达到、6.7个月，P<0.05）。FLT3-ITD突变比例≥10%的AML患者中，FLT3-ITD突变伴随NPM1或CEBPA突变患者的中位CRD显著长于单纯FLT3-ITD突变的患者（25.0个月对5.1个月，P=0.003），但两组中位OS时间差异无统计学意义（11.4个月对8.0个月，P>0.05）。
FLT3-ITD突变阳性的AML（除外M3）患者中，FLT3-ITD突变比例<10％的患者预后好于突变比例≥10％的患者。
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FLT3基因内部串联重复序列（FLT3-ITD）突变是急性髓系白血病（AML）患者独立的预后不良指标之一[1]。FLT3属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族成员之一，基因位于染色体13q12，全长有24个外显子。人FLT3基因编码993个氨基酸的蛋白质，其结构由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。ITD主要存在于FLT3胞内区结构的近膜区。FLT3-ITD突变在AML患者中检出率约为27%[2]。FLT3-ITD突变阳性的AML患者具有易复发、生存期短的特点[3,4]。FLT3-ITD突变多为插入突变，缺失或缺失/插入突变在成人AML中也有报道[5]，且不同AML患者骨髓单个核细胞存在不同的FLT3-ITD突变比例、数量和长短[6]。国外文献报道，FLT3-ITD多个突变患者的持续完全缓解时间（CRD）长于单个突变患者，但两组患者的总体生存（OS）时间差异无统计学意义[7]。国内关于此方面的研究较少，本研究旨在进一步探讨国内AML患者FLT3-ITD突变数量、长度及比例与其OS、CRD的相关性。
我院2011年1月1日至2014年11月3日门诊及住院的FLT3-ITD突变阳性的AML（除外M3）患者130例，男62例，女68例，中位年龄48(14~ 81）岁，中位随访时间为8.7(0.1~ 90.7）个月；同期门诊及住院的C-KIT突变阳性的中危组AML患者33例，男20例，女13例，中位年龄36(16~ 67）岁，中位随访时间为13.3 （5.0~ 39.2）个月。所有患者均经MICM分型，包括骨髓细胞形态学分类（FAB分型）、流式细胞术免疫分型、定量或者多重PCR检测白血病融合基因，确诊为AML。患者按照美国国立综合癌症网络（NCCN）标准进行预后分组。130例患者中103例具有详细随访资料，随访时间截止到2014年11月，其中86例患者治疗后获得完全缓解（CR），17例患者未缓解或死亡。
PCR扩增C-KIT基因8、17号外显子，NPM1基因12号外显子，FLT3基因20号外显子，DNMT3A基因第882位突变热点区域，CEBPA基因全部外显子，PCR产物采用ABI-3730型基因分析仪测序进行突变检测[8]。FLT3-ITD突变采用ABI-3730型基因分析仪进行毛细管电泳检测[9]。按下式计算FLT3-ITD突变比例。
高白细胞患者在诱导缓解化疗前单用羟基脲或联合白细胞单采清除进行预处理，诱导缓解治疗采用标准剂量的由去甲氧柔红霉素或米托蒽醌联合阿糖胞苷（Ara-C）构成的IA、MA等方案。缓解后的患者均接受了以中高剂量Ara-C为主的强化巩固治疗。41例患者在巩固治疗后接受移植治疗，其中异基因造血干细胞移植36例，自体造血干细胞移植3例，脐血移植1例，脐血＋自体造血干细胞移植1例。
按照NCCN标准进行评估，CR：外周血中性粒细胞绝对计数>1×109/L，PLT≥100×109/L，无髓外病变残留，骨髓原始细胞<0.050。OS时间为从确诊日至死亡或末次随访的时间，CRD定义为从CR日至疾病复发或者死亡的时间。
数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，两组数据的比较采用秩和检验，两组率的比较采用卡方检验，组间OS时间及CRD分析采用Kaplan-Meier方法，P<0.05为差异有统计学意义。
130例FLT3-ITD突变患者中，110例伴有单个FLT3-ITD突变，20例伴有多个FLT3-ITD突变，两组患者发病年龄、性别分布差异无统计学意义，但在60岁以上患者中多个FLT3-ITD突变发生率较单个FLT3-ITD突变发生率高，差异有统计学意义（P=0.001）（表1）。两组患者初诊时染色体核型、WBC、HGB、PLT及外周血原始细胞比例差异均无统计学意义（P值均>0.05）。单个FLT3-ITD突变患者初诊时骨髓原始细胞比例显著高于多个FLT3-ITD突变患者，差异有统计学意义（P=0.028）（表1）。单个FLT3-ITD突变接受治疗患者86例，74例获得CR；多个FLT3-ITD突变接受治疗患者17例，12例获得CR，两组患者的CR率、总移植患者比例、CR1期移植患者比例和复发率差异无统计学意义（P>0.05）。单个FLT3-ITD突变患者的突变重排插入片段长度短于多个FLT3-ITD突变患者（P=0.001）（表1），但突变比例差异无统计学意义；同样的，在治疗后CR患者中，单个和多个FLT3-ITD突变患者的ITD突变比例差异无统计学意义，但是单个FLT3-ITD突变患者的重排插入片段长度显著短于多个FLT3-ITD突变患者，差异有统计学意义（P=0.026）（表1）。单个FLT3-ITD突变与多个FLT3-ITD突变患者的OS时间差异无统计学意义（P=0.485），两组患者的中位OS时间分别为11.4和9.8个月；单个FLT3-ITD突变与多个FLT3-ITD突变患者的中位CRD差异也无统计学意义（8.0个月对6.7个月，P=0.796）（图1）。
伴单个及多个FLT3-ITD突变急性髓系白血病患者的临床特征
伴单个及多个FLT3-ITD突变急性髓系白血病患者的临床特征
| 特征 | 单个突变（110例） | 多个突变（20例） | P值 | |
|---|---|---|---|---|
| 发病年龄[岁，M（范围）] | 47.5(14~81) | 51(15~72) | 0.114 | |
| 年龄≥60岁[例(％)] | 19(17.3) | 11(55.0) | 0.001 | |
| 性别(例，男/女） | 50/60 | 12/8 | 0.340 | |
| WBC[×l09/L,M(范围）] | 41.3(1.1~477.4) | 49.9(1.4~236.6) | 0.723 | |
| HGB[g/L，M(范围)] | 82(36~155) | 69.5(41~116) | 0.194 | |
| PLT[×l09/L，M(范围）] | 40(2~2 709) | 23.5(4~144) | 0.076 | |
| 外周血原始细胞 | 0.80(0.08~0.99) | 0.76(0.47~0.93) | 0.827 | |
| 骨髓原始细胞 | 0.758(0.260~0.980) | 0.638(0.250~0.930) | 0.028 | |
| 核型异常[例(%)] | 28(28.0) | 5(25.0) | 1.000 | |
| 仅FLT3-ITD突变[例(%)] | 51(46.4) | 9(45.0) | 1.000 | |
| FLT3-ITD伴其他突变(例） | 59 | 11 | ||
| 伴CEBPA突变 | 5 | 2 | ||
| 伴C-KIT突变 | 2 | 0 | ||
| 伴NPM1突变 | 32 | 5 | ||
| 伴DNMT3A突变 | 7 | 1 | ||
| 伴DNMT3A、CEBPA突变 | 1 | 0 | ||
| 伴DNMT3A、NPM1突变 | 11 | 3 | ||
| 伴DNMT3A、NPM1、TKD突变 | 1 | 0 | ||
| 总的接受移植患者[例(％)] | 35(31.8) | 6(30.0) | 1.000 | |
| CR1期接受移植患者[例(％)] | 22(20.0) | 6(30.0) | 0.481 | |
| 获CR[例(%)] | 74(86.0) | 12(70.6) | 0.226 | |
| ITD突变长度[bp，M(范围)] | 46(6~193) | 80(18~242) | 0.001 | |
| ITD突变比例[%，M范围）] | 32.4(1.6~98.7) | 27.0(9.0~59.8) | 0.283 | |
| 治疗患者ITD突变长度[bp，M(范围）] | 46(6~171) | 68(18~242) | 0.003 | |
| 治疗患者ITD突变比例[%，M(范围）] | 33.9(1.6~98.7) | 26.5(9.6~59.8) | 0.230 | |
| CR患者ITD突变长度[bp，M(范围）] | 47(6~171) | 74(18~242) | 0.026 | |
| CR患者ITD突变比例[%,M范围）] | 31.8(1.6~98.7) | 27.0(9.6~59.8) | 0.690 | |
| 复发[例(％)] | 46(62.1) | 4(33.3) | 0.118 | |
注：单个、多个突变组接受治疗患者分别为86和17例。CR：完全缓解
FLT3-ITD突变插入重排长度中位值为52(6~242）bp。根据患者FLT3-ITD突变重排长度分为≥52 bp与<52 bp两组，两组患者外周血WBC差异有统计学意义（P=0.002），其余临床特征差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表2）。两组患者的中位OS时间分别为8.0和12.0个月，差异无统计学意义（P=0.129）；中位CRD分别为7.5和8.0个月，差异亦无统计学意义（P=0.244）。
FLT3-ITD突变长度<52 bp及≥52 bp急性髓系白血病患者的临床特征
FLT3-ITD突变长度<52 bp及≥52 bp急性髓系白血病患者的临床特征
| 特点 | 突变长度<52 bp (64例） | 突变长度≥ 52 bp(64例） | P值 | |
|---|---|---|---|---|
| 发病年龄[岁，M(范围）] | 46(14~81) | 50(17~80) | 0.196 | |
| 年龄≥60岁[例(％)] | 12(18.8) | 13(20.3) | 1.000 | |
| 性别(例，男/女） | 34/30 | 26/38 | 0.215 | |
| WBC[×l09/L，M(范围）] | 27.0(1.1~283.5) | 71.6(1.4~477.4) | 0.002 | |
| HGB[g/L，M(范围）] | 82(36~155) | 77.5(37~142) | 0.380 | |
| PLT[×l09/L，M范围）] | 38(2~432) | 43.5(6~2 709) | 0.615 | |
| 外周血原始细胞 | 0.775(0.15~0.96) | 0.76(0.08~0.97) | 0.749 | |
| 骨髓原始细胞 | 0.730(0.300~0.980) | 0.758(0.250~0.980) | 0.653 | |
| 核型异常[例(％)] | 20(34.5) | 15(24.2) | 0.299 | |
| 仅有FLT3-ITD突变[例(％)] | 32(50.0) | 26(40.6) | 0.375 | |
| FLT3-ITD伴其他突变(例） | 32 | 38 | ||
| 伴CEBPA突变 | 5 | 2 | ||
| 伴C-KIT突变 | 1 | 1 | ||
| 伴NPM1突变 | 14 | 22 | ||
| 伴DNMT3A突变 | 5 | 3 | ||
| 伴DNMT3A、CEBPA突变 | 1 | 0 | ||
| 伴DNMT3A、NPM1突变 | 5 | 10 | ||
| 伴DNMT3A、NPM1、TKD突变 | 1 | 0 | ||
| 总的接受移植患者[例(％)] | 18(28.1) | 22(34.4) | 0.567 | |
| CR1民期接受移植患者[例(％)] | 11(17.2) | 17(26.6) | 0.285 | |
| 获CR[例(％)] | 43(86.7) | 41(83.7) | 1.000 | |
| CR患者ITD突变比例[%，M(范围)] | 32.7(1.7~98.7) | 30.4(1.6~68.2) | 0.781 | |
| 复发[例(％)] | 24(55.8) | 24(58.5) | 0.975 | |
注：共128例患者进行FLT3-ITD突变长度检测。CR：完全缓解
比较FLT3-ITD突变比例<10%、突变比例≥10%和C-KIT突变的中危组三组患者的OS和CRD，差异均有统计学意义（P<0.001和P=0.004）（图2、图3）。其中FLT3-ITD突变比例<10％的AML患者的OS时间、CRD均长于突变比例≥10％的AML患者，差异有统计学意义（中位OS时间为未达到、9.9个月，P＝0.004；中位CRD为未达到、6.7个月，P=0.045）；而FLT3-ITD突变比例<10% AML患者与C-KIT突变的中危组AML患者的OS及CRD相似，差异无统计学意义（P值分别是0.989、0.886）。FLT3-ITD突变比例≥10% AML患者与C-KIT突变的中危组AML患者的OS及CRD差异有统计学意义（P值分别是0.000、0.002）。进一步比较FLT3-ITD突变比例<10％和≥10％患者临床特征发现，两组患者发病年龄、性别分布、初诊时外周血细胞计数、骨髓原始细胞比例、染色体核型、ITD突变片段长度及是否伴随其他突变差异均无统计学意义，两组患者治疗后CR率、总的移植患者比例、CR1期移植患者比例及复发率差异亦无统计学意义（P>0.05）。
去除FLT3-ITD突变比例<10％的AML患者后，将FLT3-ITD突变比例≥10％的患者分为单纯FLT3-ITD突变、FLT3-ITD突变伴随NPM1或CEBPA突变和FLT3-ITD突变同时伴随NPM1、DNMT3A突变三组，三组患者的中位OS时间分别为8.0、11.4和12.0个月，差异无统计学意义（P=0.273）；中位CRD分别为5.1、25.0和9.0个月，差异有统计学意义（P＝0.010）（图4）；其中FLT3-ITD突变伴随NPM1或CEBPA突变患者的CRD显著长于单纯FLT3-ITD突变的患者（中位数25.0和5.1个月，P=0.003），余两两比较差异无统计学意义（P> 0.05）。
本研究结果显示单个FLT3-ITD突变与多个FLT3-ITD突变AML患者的OS时间差异无统计学意义，两组CRD差异亦无统计学意义，结果同文献[7]报道不同，可能与样本量、人种和（或）治疗方案差异有关。此外，60岁以上AML患者中多个FLT3-ITD突变发生率显著高于单个FLT3-ITD突变发生率。并且，多个FLT3-ITD突变患者的最大重排长度要长于单个FLT3-ITD突变患者的重排长度。这些结果均表明，患者年龄越大FLT3-ITD突变重排长度越长，基因组水平越不稳定。同时，在研究中我们还发现2例患者初检时FLT3-ITD突变为阴性，疾病复发时FLT3-ITD突变转为阳性，第1例初诊伴NPM1、DNMT3A突变，复发时伴NPM1、DNMT3A及FLT3-ITD （27 bp，32.7%）突变；第2例初诊伴NPM1突变，复发时伴NPM1及FLT3-ITD(30 bp，42.0%）突变。3例患者复发后FLT3-ITD突变不同于初诊检测，第1例初诊FLT3-ITD突变有3个片段：18、30、48 bp，对应的突变比例为2.7%、3.7%、3.2%，疾病缓解后突变持续阳性，疾病复发后1.6个月检测FLT3-ITD突变长度79 bp，突变比例32.9%。第2例初诊时FLT3-ITD突变长度30 bp，突变比例32.0%，疾病缓解后突变持续阳性，疾病复发后1.3个月检测FLT3-ITD突变长度70 bp，突变比例31.2%。第3例初诊时FLT3-ITD突变有2个片段：48和59 bp，突变比例为25.1％和9.9%，CR1持续0.8个月后复发，而在CR2期FLT3-ITD突变初次转阴，CR2持续0.7个月后再次复发，第2次复发检测FLT3-ITD突变有3个片段：36、48和59 bp，对应突变比例为3.7%、5.1%、26.6%。文献中报道FLT3-ITD突变存在于白血病干细胞[10]，对伴FLT3-ITD突变的患者进行治疗后，最初优势克隆群体可能会被最初的劣势克隆群体取代，甚至产生新的克隆群体，引起疾病复发或耐药[11,12,13,14]。
国外文献中报道FLT3-ITD突变重排插入片段大小对患者的预后意义是有争议的[15,16,17]。本研究中我们发现130例中国FLT3-ITD突变AML患者重排插入片段的中位长度为52 bp，根据FLT3-ITD突变插入重排长度将患者分为≥52 bp与<52 bp两组，虽然FLT3-ITD突变插入片段长度≥52 bp患者的WBC显著高于FLT3-ITD突变插入片段长度<52 bp患者，但两组患者OS时间和CRD差异均无统计学意义。
本研究中我们对130例AML（除外M3）患者的FLT3-ITD突变比例和预后进行分组分析，发现FLT3-ITD突变比例<10％患者的OS时间、CRD均显著长于突变比例≥10％患者，差异有统计学意义。这一结果与国外报道相似，FLT3-ITD突变比例高的AML患者预后较差[18]。此外，本研究结果还表明FLT3-ITD突变比例<10％的患者预后与C-KIT突变阳性的中危组AML患者相似，两组患者OS时间差异无统计学意义。FLT3-ITD突变比例与AML患者预后密切相关，同时其伴随突变也会影响患者的预后[19,20,21]。在研究中我们发现NPM1突变伴随FLT3-ITD突变患者不会同时存在CEBPA突变，同样的CEBPA突变伴随FLT3-ITD突变患者不存在NPM1突变，这一结果与国外文献[20]报道相符。我们还发现，FLT3-ITD突变伴随NPM1或CEBPA突变患者的CRD显著长于单纯FLT3-ITD突变的患者，差异有统计学意义。这一结果说明AML患者发生FLT3-ITD突变的同时，若伴有预后良好的分子标志可以改善患者的CRD。
综上所述，FLT3-ITD突变阳性的AML（除外M3）患者中，FLT3-ITD突变比例<10％的患者预后好于突变比例≥10％的患者。
