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血友病A是由凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因突变导致的一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，通常是由无症状的女性携带者传递给其儿子，男性患病率为1/5 000~10 000[1]。血友病A的发病机制复杂多样，其突变位点覆盖整个FⅧ基因，主要包括内含子22及1倒位、无义突变、错义突变、插入及缺失等，其中约45％的重型血友病A是由内含子22倒位引起，而轻型和中间型血友病A最常见的突变类型是错义突变[2]。我们对一个血友病A家系进行凝血功能检测和基因分析，报告如下。
先证者：男，38岁，自幼反复发作膝关节及肌肉自发出血，通过APTT与FⅧ活性（FⅧ∶C）检测确诊为重型血友病A，平时以FⅧ制剂、冷沉淀或新鲜血浆间断替代治疗。先证者父母非近亲结婚，家系其他成员均无出血病史，家系图见图1。以50名健康男性志愿者作为对照排除基因多态性。本研究经医院伦理委员会批准，并征得患者及家属知情同意。
采集受检者外周静脉血3 ml（EDTA抗凝），测定凝血指标并采用Wizard® Genomic DNA Purification Kit（美国Promega公司产品）提取外周血基因组DNA，-80 ℃冻存备用。
应用法国STA-R全自动血凝仪检测凝血酶原时间（PT）、APTT、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）及凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ促凝活性，加正常血浆作凝血延长的纠正试验；采用ELISA法测定血管性血友病因子抗原（VWF∶Ag）水平。
根据FⅧ基因序列（GenBank编号CM000685.1），参考文献[3,4]设计引物用于FⅧ基因内含子1及22倒位检测；应用Primer 5软件，参考文献[5,6,7]设计38对引物，覆盖FⅧ基因所有外显子、启动子以及曾有报道发生突变的内含子9、13、16、18、25区域。
采用倒位PCR法检测FⅧ基因内含子1及22倒位[4]；PCR扩增FⅧ基因所有外显子、启动子及内含子9、13、16、18、25区域，参照HAMSTERS数据库（http://hadb.org.uk/）设计引物和反应条件。扩增产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳并割胶纯化，制备测序模板，由武汉康圣达医学检验所采用Sanger法完成测序（ABl3730测序仪）。
先证者无明显皮肤黏膜出血倾向，右膝关节轻度畸形。APTT 101.5 s（正常参考值25.4~ 38.4 s），能被正常血浆纠正，F Ⅷ∶C 1.1%（正常参考值50.0%~150.0%），凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ促凝活性及VWF∶Ag含量均正常。其他家系成员上述凝血指标均正常。
倒位PCR未检出先证者FⅧ基因内含子1及22倒位。Sanger测序在启动子及内含子9、13、16、18、25区域均未检出突变，而在5号外显子检出c.608T>C (Leu203Pro）错义突变（导致第203位上的核苷酸由亮氨酸变为脯氨酸）（图2A）。对6名其他家系成员进行相应位点检测发现，先证者的父亲及外甥女均检出14号外显子c.3780C>G（p.Asp1260Glu）错义突变（导致第1260位上的核苷酸由天门冬氨酸变为谷氨酸）（图2B），其母亲及2个女儿均携带c.608T>C（Leu203Pro）杂合突变，妹妹携带c.608T>C和c.3780C>G双重突变。另外，先证者及其母亲、妹妹与2个女儿均检出14号外显子c.3864A>C（p.Ser1288Ser）同义突变。经PolyPhen- 2与Mutation Taster软件预测，c.608T>C (Leu203Pro）突变对蛋白功能的影响均为有害，而c.3864A> C（p.Ser1288Ser）突变为单核苷酸多态性位点（无致病性）。在50名健康对照者中未发现上述FⅧ基因突变。
A: 5号外显子c.608 T> C；B: 14号外显子c.3780 C > G
FⅧ基因位于染色体Xq28，全长186 kb，包含26个外显子和25个内含子，编码约9 kb的mRNA。FⅧ主要在肝脏合成，是2 332个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，由3个A区、1个B区、2个C区及3个短的富含带负电荷的氨基酸残基a区组成A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2结构[8]。A区与FⅧ的蛋白质合成及其活化密切相关，B区通过调节FⅧ的分泌影响其活性。FⅧ蛋白活性主要取决于FⅧ氨基酸残基组成和结构的完整性，突变可引起FⅧ部分氨基酸残基缺失、替换及蛋白质构象改变进而影响FⅧ蛋白发挥正常功能。人类突变数据库的最新统计数据显示，目前已发现2 517种FⅧ基因突变，无义突变、大片段缺失、内含子22及1倒位常引起FⅧ蛋白大部分缺失而致重型血友病A，错义突变、小片段缺失及插入常引起个别氨基酸残基替换而导致轻／之间型血友病A，其中80％以上为错义突变。
FⅧ基因内含子22倒位是一个最常见的突变，可造成FⅧ基因中断而导致重型血友病A；内含子1倒位较为罕见，约5％的重型血友病发病机制与其有关[9]，FⅧ基因启动子区域位点突变与轻型血友病发病有关[10]。另有文献报道，在FⅧ基因内含子9、13、16、18及25分别检出IVS9+326A>G、IVS13 + 1152delA、IVS16- 93C>T、IVS18- 277G>A、IVS25 + 4104A>T突变[6,7]。本家系的所有成员均未检出FⅧ基因内含子及启动子区域的突变。在先证者及其母亲、妹妹与2个女儿均检出14号外显子c.3864A>C同义突变，经PolyPhen-2和Mutation Taster软件检索该突变为无致病性的单核苷酸多态性位点，与该家系血友病A的发病无关。
14号外显子处于FⅧ基因序列2 110~5 220碱基的位置，编码A2、B及A3区的685~1 721位氨基酸[11]，其结构在转录、翻译以及剪切为有活性的FⅧ方面均具有重要作用。通过切割B区的大部分氨基酸单链将FⅧ转变为活性形式，其余部分构成A2和A3区，因此FⅧ基因B区的错义突变较少[12]，多数可能为基因多态性或非致病性突变[13]。但也有研究发现，在120例血友病A中有2个家系的3例重型患者存在位于B区的c.3780C>G（p.Asp1260Glu）错义突变[2]，该突变可导致FⅧ∶C降低[14,15]。有学者研究了该突变对FⅧ∶C的影响，发现p.Asp1260Glu的核苷酸多态性呈现HT1、HT3及HT5三种不同的单倍型，只有HT1型的男性患者FⅧ∶C降低，女性携带者不影响FⅧ∶C，而HT3、HT5亚型所占比例很低，亦不影响FⅧ∶C[16]。本家系先证者父亲FⅧ∶C正常，推测可能为HT3或HT5亚型突变所致；先证者妹妹及外甥女FⅧ∶C正常，可能与她们携带的c.3780C>G突变不影响FⅧ∶C有关。
本家系先证者检出FⅧ基因5号外显子c.608T>C突变，其母亲、妹妹及2个女儿均携带c.608T>C杂合突变。通过查询相关网站数据库及文献检索，表明该突变为首次报道。FⅧ基因4~7号外显子编码FⅧ蛋白A1亚基的第111~317位氨基酸，与FⅧ合成及其活化密切相关。本家系检出的5号外显子c.608T>C（p.Leu203Pro）突变位于此区域内，可能影响了FⅧ蛋白构象而导致FⅧ∶C降低[17]，并且PolyPhen-2与Mutation Taster软件预测蛋白功能均为有害，因此推测新发现的c.608T>C突变是该血友病A家系的致病突变。
