通过分析血常规、血清铁含量及血红蛋白电泳对地中海贫血(地贫)检出率的影响，寻找在地贫非高发区高效的联合检测方法。
抽取上海交通大学医学院附属瑞金医院门诊血液科及妇产科1 000例疑诊地贫患者外周血，EDTA抗凝管及血清管。抽提全血DNA，以跨越裂口PCR(GAP-PCR)及反向斑点杂交法进行地贫常见突变基因检测；进行血常规及血红蛋白电泳检测；GAPPCR及Sanger法测序进行稀有α及β地贫基因检测；作血清铁含量测定。
1 000份标本经常规基因检测，诊断α地贫225例(22.5%)，其中静止型28例，标准型138例及HbH病59例；β地贫403例(40.3%)，其中β地贫携带者390例，β双重杂合子7例以及β纯合子6例；αβ复合地贫15例(1.5%)；未检出常见突变的有357例。1 000例患者中红细胞平均体积(MCV)或红细胞平均血红蛋白含量(MCH)增高的有38例，无一例检出地贫基因；血清铁含量增高且MCV不增高的48例患者，42例(87.5%)检出地贫基因；血红蛋白电泳异常的38例患者中35例为HbH病，另3例为HbF含量高的其他类型地贫患者，符合率为100%。1 000例患者中，有5例患者血红蛋白电泳异常并伴有MCV及MCH降低、血清铁不低，虽常规基因检测未发现突变，经进一步测序分析，均发现稀有突变。
MCV及MCH不低于正常参考范围可基本排除地贫，血清铁含量高为地贫提示及分类指标，血红蛋白电泳异常提示地贫可能。此三者联合检查结果均异常而基因检测未显示异常的，建议进一步进行稀有分型的测序分析。三者联合检测可提高非地贫患者的排除率及地贫患者的检出率。
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地中海贫血(地贫)是一组严重威胁人类健康的遗传性血液病，地贫基因携带者表现为临床症状轻重不等的慢性进行性溶血性贫血[1]。我国广东、广西、海南及福建等地均为地贫高发地区，以α和β珠蛋白生成障碍最为常见[2,3]。近年来，上海地区地贫检出率也逐年增高，在未开展基因筛查的情况下，我们试图通过血常规、血清铁含量及血红蛋白电泳的联合检测来提高地贫的排除率及检出率，也为进一步的地贫基因测序提供依据。
以2012年3月至2015年10月来我院就诊的疑诊地贫患者1 000例为研究对象。抽取静脉血3 ml，EDTA-K2抗凝，分别用于血常规、血红蛋白、地贫基因分析和DNA测序；血清管离心后得到血清2 ml，用于血清铁检测。标本保存：全血室温不超过24 h；血清2~8 ℃不超过1周；DNA-18 ℃保存不超过2年，-70 ℃可长期保存，冷冻保存避免反复冻融。
采用XS-800i全自动血液分析仪(日本SYSMEX株式会社产品)进行血常规检测，测定红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)HGB等参数。MCV正常参考范围为>99.1 fl；MCH正常参考范围为男>33.8 pg、女>33.3 pg；HGB正常参考范围为男>160 g/L、女>150 g/L。
采用D-10血红蛋白检测仪(美国Bio-Rad公司产品)检测HbA、HbA2、HbF及异常血红蛋白含量。
采用跨越裂口PCR(Gap-PCR)方法检测--SEA、-α3.7和-α4.2基因缺失三种缺失型。采用反向斑点杂交(RDB)法对α和β地贫非缺失型点突变基因进行检测，包括3种α2珠蛋白基因突变类型αWS、αQS及αCS和17种β珠蛋白基因突变类型[-28、-29、-30、-32、CD14-15、CD17、CD26(βE)、CD27-28、CD31、CD41-42、CD43、CD71-72、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、CAP + 1、initiation condon]。地贫基因检测试剂盒购自深圳亚能生物有限公司。按照试剂盒说明书进行操作和结果判断。
对于血红蛋白电泳异常或血清铁含量异常增高而无法用常规地贫基因检测结果解释或实验室结果无法解释临床表型的患者，血样送深圳亚能生物有限公司进行DNA测序。针对怀疑β珠蛋白基因突变的，进行Taiwanese、γ+(αγδβ)0、SEA-HPFH以及β珠蛋白基因测序；针对怀疑α珠蛋白基因突变的，进行Thai、α2、α1基因测序，X1/X2融合片段(HKαα或anti4.2的特异片段)扩增。
采用EXCEL 2013及SAS 9.0统计软件进行数据分析；用描述性方法分析各参数对地贫检出率的影响。正态分布的指标组间比较用t检验，非正态分布的指标取自然对数后进行t检验，组间用GLM相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
经地贫基因检测试剂盒进行常规基因检测，在1 000份标本中，检出α地贫225例(22.5%)，β地贫403例(40.3%)，αβ复合地贫15例(1.5%)，未检出357例(35.7%)。α地贫中，标准型最多，占61.3%(138/225)。静止型28例；HbH病59例。β地贫中，IVS-Ⅱ-654(163/418)和CD41-42(141/418)两种基因突变最常见，各基因突变频率及等位基因频率见表1。
各基因突变频率及等位基因频率(‰)
各基因突变频率及等位基因频率(‰)
| 分类 | 基因 | 突变频率 | 等位基因频率 |
|---|---|---|---|
| α地贫 | --SEA | 199 | 99.5 |
| -α3.7 | 63 | 31.5 | |
| -α4.2 | 17 | 8.5 | |
| αWS | 10 | 5.0 | |
| αQS | 6 | 3.0 | |
| αCS | 24 | 12.0 | |
| β地贫 | CD14-15 | 3 | 1.5 |
| CD17 | 80 | 40.0 | |
| -28 | 17 | 8.5 | |
| CD27-28 | 8 | 4.0 | |
| CD41-42 | 141 | 70.5 | |
| IVS-Ⅰ-1M | 1 | 0.5 | |
| IVS-Ⅰ-5M | 2 | 1.0 | |
| IVS-Ⅱ-654 | 163 | 81.5 | |
| CD26(βE) | 3 | 1.5 | |
| CD43 | 2 | 1.0 | |
| CD71-72 | 12 | 6.0 |
注：地贫：地中海贫血
MCV、MCH或HGB高于正常参考范围的有38例，无一例检出地贫基因。在地贫患者中，以β纯合子及β双重杂合子的HGB最低，HbH患者次之。α静止型的MCV为(82.4±1.1)fl, MCH为(25.8±1.1)pg，仅轻微低于正常参考值范围，HGB为(122±1.2)g/L，基本接近正常参考范围(表2)。
不同基因类型地贫患者年龄及血常规参数比较(
±s)
不同基因类型地贫患者年龄及血常规参数比较(±s)
| 组别 | 例数 | 年龄(岁) | MCV(fl) | MCH(pg) | HGB(g/L) |
|---|---|---|---|---|---|
| α静止型 | 28 | 30.1±1.3 | 82.4±1.1A | 25.8±1.1a | 122.0±1.2 |
| α标准型 | 138 | 24.8±2.2 | 69.3±1.1B | 21.4±1.1b | 114.0±1.2 |
| HbH病 | 59 | 23.6±1.8 | 64.8±1.1B | 19.0±1.2c | 83.3±1.2 |
| β地贫携带者 | 390 | 23.3±2.6 | 65.7±1.1B | 20.7±1.1bc | 98.3±1.2 |
| β纯合子 | 6 | 3.0±1.9 | 76.6±1.1A | 25.1±1.1a | 59.2±1.3 |
| β双重杂合子 | 7 | 1.5±5.0 | 67.7±1.1B | 20.3±1.2bc | 50.2±1.4 |
| αβ复合地贫 | 15 | 19.3±3.0 | 64.8±1.1B | 20.7±1.1bc | 100.4±1.3 |
注：地贫：地中海贫血；MCV：红细胞平均体积；MCH：红细胞平均血红蛋白含量；各组数值非全部组都呈正态分布而转换成自然对数后进行统计学描述，用GLM进行组间相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义，具有相同上标的为差异无统计学意义
血清铁含量高于正常参考范围且MCV未高于正常参考范围的48例患者，检出地贫基因的有42例(87.5%)。β地贫患者血清铁含量高于α地贫患者，又以纯合子及双重杂合子更高，血清铁含量最高的为β纯合子，达到(39.1±1.0)mol/L，最低的是αβ复合地贫[(13.1±1.4)mol/L](表3)。
不同基因类型地中海贫血(地贫)患者血清铁及血红蛋白电泳检测结果(
±s)
不同基因类型地中海贫血(地贫)患者血清铁及血红蛋白电泳检测结果(±s)
| 组别 | 例数 | 血清铁(mol/L) | HbA(%) | HbA2(%) | HbF(%) |
|---|---|---|---|---|---|
| α静止型 | 28 | 16.3±1.7bc | 97.0±1.0 | 1.8±2.1 | 0.6±1.8 |
| α标准型 | 138 | 13.6±1.7c | 97.0±1.0 | 1.9±1.5 | 0.8±2.0 |
| HbH病 | 59 | 18.8±1.5abc | 87.3±1.1 | 0.9±2.1 | 1.6±2.5 |
| β地贫携带者 | 390 | 19.8±1.6abc | 90.7±1.1 | 4.7±1.6 | 2.5±2.4 |
| β纯合子 | 6 | 39.1±1.0a | 32.0±4.0 | 1.8±2.4 | 36.2±2.2 |
| β双重杂合子 | 7 | 36.4±1.4ab | 24.3±3.1 | 3.0±4.5 | 30.5±4.7 |
| αβ复合地贫 | 15 | 13.1±1.4c | 78.3±1.6 | 4.6±1.7 | 2.5±5.1 |
注：各组数值非全部组都呈正态分布而转换成自然对数后进行统计学描述，方差分析P<0.05为差异有统计学意义，具有相同上标的为差异无统计学意义
α地贫的HbA2为1.44%，明显低于正常参考范围，以HbH病最低(0.9%)；β地贫的血红蛋白电泳结果中，HbA2达到了(4.5±1.7)%，显著高于正常参考范围(P<0.01)，HbF也高达(4.6±1.3)%。检出有血红蛋白电泳异常的38例，其中35例均为HbH病患者，另3例为HbF含量高的其他类型地贫患者，符合率为100%。5例患者血红蛋白结果异常并伴有MCV及MCH小于正常参考范围，试剂盒未检出基因异常而经测序分析，均发现伴有不同的稀有突变。
血红蛋白病遍布全球近160个国家，据WHO估计，全球有近5亿人口为地贫基因携带者，占总人口的7%。据现有流行病学调查资料显示，我国南方地区人群的α地贫基因携带者检出率为2%~18%，β地贫基因为1%~7%。根据遗传平衡定律，在一个稳定的人群中，地贫基因携带率是不会有太大改变的。而在上海地区，检测到的β地贫多于α地贫，我们推测导致这种结果的可能性有两个：①地贫基因具有遗传异质性，中国的南方地区与华东地区有显著的地域差异；②本组患者多因贫血而就诊，而静止型α地贫患者往往无贫血表现，仅在体检筛查中被发现。我们检出的418例β地贫携带者中，IVS-Ⅱ-654和CD41-42最常见，与文献[4]报道一致。
多数地贫基因携带者可表现为MCV和MCH降低的小细胞低色素贫血[5,6]。在我们检测的1 000份标本中，通过患者MCV、MCH或HGB增高而初步准确排除地贫的患者有38例，经基因检测验证，无一例为地贫基因携带者，排除率达到100%。而需要注意的是，若MCV、MCH或HGB这三个指标正常，并不能排除地贫，可能会造成某些型别特别是α静止型的漏诊。
地贫是一类铁利用障碍性贫血，大部分患者在可出现血清铁增高[7]。在MCV、MCH及HGB这三项指标未能排除地贫且血清铁含量增高的48例患者中，我们检出了42例(87.5%)β地贫患者。由此可见，血清铁含量有助于诊断β地贫，且在我们的研究中发现β地贫患者与未查出地贫的患者的血清铁的差异有统计学意义(P<0.01)，而对于α地贫，尤其是α静止型患者，血清铁的作用略小(P=0.1112)。值得注意的是，在同时伴有缺铁的地贫患者，仅凭借血清铁将低而排除地贫引起漏诊。在临床上，也可见合并缺铁性贫血的女性或儿童地贫患者，并且有时MCV的界限可疑，可能是由于维生素B12缺乏所致。
地贫患者由于合成珠蛋白链的基因突变，导致血液中血红蛋白成分发生改变，产生α、β链的不平衡，或合成异常血红蛋白而产生包涵体，表现为血红蛋白电泳结果异常，HbA2被视为β地贫的良好检出指标[6]。地贫患者就诊的年龄往往与患者的临床症状有关，就诊年龄最低的为β纯合以及β双重杂合患者，HGB仅为(54.5±1.4)g/L，临床表现为重度贫血，血红蛋白电泳表现为特征性的HbF升高(34.0%)。β地贫携带者一般为轻度贫血，但是MCV和MCH的改变较为明显，最常见的3种β突变基因分别为β+的41-42/N[HGB为(99.1±1.2)g/L]、β0的654/N[HGB为(97.5±1.3)g/L]和β0的17/N[HGB为(96.7±1.2)g/L]，虽然其血红蛋白链的完整性与功能上有差别，但其HGB(P=0.664)、MCV(P= 0.071)及MCH(P=0.479)间的差异无统计学意义，与文献[6]不一致，其原因有待进一步研究。β地贫携带者最显著的特征是在血红蛋白电泳中，HbA2(5.1%)及HbF(4.3%)显著升高。本组38例血红蛋白电泳异常的患者中35例有HbH条带，基因检测证实为HbH，另3例经证实为其他类型地贫，符合率高达100%，由此可见特征性的异常血红蛋白电泳条带在地贫的分型判断中有相当重要的意义。
我们发现5例患者血红蛋白结果异常(HbA2或HbF异常升高)，排除缺铁引起的MCV及MCH降低，但常规基因检测未发现突变，进行进一步的测序分析，发现其中的5例为稀有突变的地贫携带者。
综上所述，血常规、血清铁以及血红蛋白电泳的联合检测，可以根据MCV、MCH及HGB排除一部分非地贫患者；同时可以通过HbA2及血清铁含量对地贫患者进行初步分类；血红蛋白电泳可以作为地贫诊断依据之一。因而这三者的联合筛查对于常规基因检测不能诊断的稀有地贫可起到良好的提示作用，减少漏检。在地贫的非高发区，在地贫基因测序的相对较高检测费用的情况下，联合筛查具有一定的经济优势；同时对于在地贫非高发区进行常见突变基因未能发现突变的漏检地贫的诊断，也显示出不可或缺的作用。
