研究靶向抑制miRNA-21表达对K562细胞生物学功能的影响，观察其对PTEN-PI3K/AKT通路相关分子表达水平的影响，探讨其在白血病发病机制中的作用。
将化学合成的miRNA-21抑制物电转染K562细胞，RT-PCR检测K562细胞miRNA-21表达变化，MTT法检测miRNA-21对K562细胞活力影响，流式细胞术分析miRNA-21对K562细胞凋亡的影响，应用Western blot技术检测K562细胞中PTEN、PI3K及p-AKT蛋白表达水平。
转染24 h实验组miRNA-21 mRNA相对表达水平为（8.070±5.138）%，低于各对照组（P <0.05）。转染24 h实验组K562细胞凋亡率为（13.370±0.250）%，高于各对照组（P<0.01）。实验组K562细胞的增殖抑制率由转染后24 h的（8.1± 0.9）％升至60 h的（43.1±2.1）%。成功抑制miRNA-21表达后，与对照组相比，K562细胞凋亡增加（P< 0.01），细胞中PTEN蛋白表达上调（P<0.01），PI3K及p-AKT蛋白表达下调（P<0.01）。
靶向抑制K562细胞miRNA-21可以上调PTEN表达而抑制PI3K/AKT信号通路，发挥其抑制K562细胞增殖及促进凋亡作用。
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微小RNA （miRNA）是一类长度为19~25个核苷酸的非编码单链RNA分子。miRNA表达具有明显的组织细胞特异性，且与肿瘤的发生发展密切相关[1]。miRNA-21是miRNA家族的重要成员之一，可通过调控其靶基因参与的信号通路影响肿瘤的发生发展，发挥类似于癌基因或抑癌基因的功能。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）为已知的抑癌基因，为miRNA-21靶基因之一[2]。PTEN基因可以通过其磷酸酶活性阻断细胞因子介导的信号转导通路，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）／丝-苏氨酸激酶（AKT）信号途径，从而抑制肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，促进肿瘤细胞凋亡[3]。目前，对于抑制miRNA-21表达对K562细胞生物学功能影响的研究甚少，且miRNA-21与PTEN-PI3K/AKT通路在白血病发病中的作用机制尚不明确。本研究中，我们观察靶向抑制K562细胞中miRNA-21表达对PTEN-PI3K/AKT通路中相关分子表达的影响，探讨其在白血病发病机制中的作用。
miRNA-21抑制物（含绿色荧光素FAM）及其阴性对照由广州复能基因公司合成并验证；细胞培养基RPMI 1640购自美国Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青公司；细胞总RNA提取试剂TRIzol购自美国Invitrogen公司；MTT试剂盒、磷酸盐缓冲液（PBS）购自美国Sigma公司；AnnexinⅤ和碘化丙锭（PI）购自瑞士Roche公司；RT-PCR试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司公司；miRNA-21及内参U6引物、PTEN及内参ACTB引物均购自广州复能基因有限公司；鼠抗人PTEN单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；兔抗人PI3K多克隆抗体、兔抗人p-AKT多克隆抗体、兔抗人GADPH多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。MiRNA-21抑制物由广州复能基因有限公司合成（5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'）。
将K562细胞（由本实验室保存）接种于含10% FBS、青霉素100 mg/L、链霉素100 mg/L的RPMI 1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每1~2 d换液传代，实验选用对数生长期细胞。
①K562NC组：空白对照组（未处理的K562细胞）；②K562MI组：转染miRNA-21抑制物；③ K562NM组：转染随机序列（长度与miRNA-21抑制物相同）对照；④K562FAM组：转染荧光素FAM对照。
取1 × 106/ml K562细胞，加入400 μl电转缓冲液和200 nmol miRNA-21抑制物，应用BTX ECM830电转染仪转染（300 V、60 ms、2次）。转染后细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养液培养。在转染24 h后采用荧光倒置显微镜观察细胞形态并提取细胞总RNA行RT-PCR检测，60 h后提取细胞总蛋白行Western blot检测。
转染24 h后收集细胞，于荧光倒置显微镜下观察，计数荧光素FAM表达阳性细胞及视野内全部细胞数量，按以下公式计算转染率：
检测转染后细胞miRNA-21表达变化，细胞总RNA提取及逆转录反应按照说明书进行，引物序列如下：miRNA-21上游引物：5'-CACCTAGCTTATCAGACTGATGTTGATTTTTTG-3'，下游引物：5'-AGCTCAAAAAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'；内参U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。PCR反应条件：预变性95 ℃ 10 min 1个循环；变性95 ℃ 10 s，退火56 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 15 s, 40个循环。实验设3个复孔，重复3次。
取各组1×106/ml K562细胞，接种于96孔无菌培养板中（每孔200 μl），于转染后12、24、36、48、60 h检测K562细胞的增殖情况。每次测定时孔中加入10 mg/ml MTT液10 μl，孵育4 h后用平板离心机离心10 min (2 500×g），弃上清，再加入200 μl二甲基亚砜终止反应，用全自动酶标仪测定490 nm处吸光度（A）值。实验重复3次，结果取均值。按以下公式计算细胞增殖抑制率。根据时间及增殖抑制率值绘制生长曲线。
转染48 h后，收集1×106/ml K562细胞，用PBS吹打洗涤2次，离心后弃上清，加入500 μl 1×Binding Buffer重悬细胞，并加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC及10 μl PI，混匀后避光室温孵育10 min，上机分析细胞凋亡情况。
用细胞蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，行SDS-PAGE分离蛋白（90 V 30 min, 120 V 1 h）。电泳结束后以电转移法将蛋白从凝胶转移到聚偏氟乙烯（PVDF ）膜上，用5% BSA液封闭，依据膜面积计算抗体体积，分别加入PTEN、PI3K、p-AKT对应一抗（稀释比例分别为1∶300、1∶500、1∶500）室温孵育1 h，然后再加入对应二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，最后将PVDF膜用ECL化学发光试剂盒处理并显影，检测阳性蛋白的表达水平。实验重复3次。
采用SPSS 13.0统计软件对实验结果进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示，各组间比较采用方差分析及q检验，P<0.05差异有统计学意义。
通过荧光倒置显微镜观察转染后细胞形态变化，转染后24 h的部分K562细胞发出绿色荧光信号，部分细胞膨胀，细胞壁有皱褶或破损，形态完整（图1）。转染率为（53.4±3.2）%。
K562MI、K562NM、K562FAM组miRNA-21表达水平分别为K562NC组的（8.070 ± 5.138）%、（91.600±2.452）%、（92.247±2.053）%，表明miRNA-21抑制物成功转染K562细胞并下调miRNA-21表达。
转染24、36、48、60 h，K562MI组细胞增殖抑制率均高于K562NM、K562FAM组（P <0.05 ）。随着时间延长，K562MI组细胞增殖抑制率逐渐增高（ P<0.05 ），由转染24 h的（8.1±0.9）％升至60 h的（43.1±2.1）%，表明靶向抑制miRNA-21可以抑制K562细胞增殖。K562NM、K562FAM两组随着时间延长细胞增殖抑制率无明显变化（P>0.05 ）。详见图2。
K562MI组：转染miRNA-21抑制物；K562NM组：转染随机序列对照（长度与miRNA-21抑制物相同）；K562FAM组：转染荧光素FAM对照
转染48 h后K562NC、K562MI、K562NM及K562FAM组细胞凋亡率分别为（2.334 ± 0.263）%、（13.370 ± 0.250）%、（3.990 ± 0.436）%、（2.894±0.352）% ，K562MI组细胞凋亡率高于其他三组（P<0.01），提示下调miRNA-21表达可以促进K562细胞凋亡（图3）。
K562NC组：空白对照组（未处理K562细胞）；K562MI组：转染miRNA-21抑制物；K562NM组：转染随机序列对照（长度与miRNA-21抑制物相同）；K562FAM组：转染荧光素FAM对照
Western blot检测显示（以GADPH作为内参照）：K562MI组较其他3组细胞PTEN蛋白表达上调，PI3K及p-AKT蛋白表达下调，差异均有统计学意义（P<0.05 ）（表1、图4），说明靶向抑制miRNA-21表达可以实现对PTEN-PI3K/AKT相关基因蛋白水平调控。
1：K562NC组（空白对照）；2：K562MI组（转染miRNA-21抑制物）；3：K562NM组（转染随机序列对照）；4：K562FAM组（转染荧光素FAM对照）
靶向抑制miRNA-21表达对K562细胞PTEN-PI3K/AKT通路蛋白表达水平影响（
±s）
靶向抑制miRNA-21表达对K562细胞PTEN-PI3K/AKT通路蛋白表达水平影响（±s）
| 组别 | PTEN | PI3K | p-AKT |
|---|---|---|---|
| K562NC | 4.911±0.450 | 3.343±0.201 | 3.040±0.094 |
| K562MI | 14.701±0.810a | 1.015±0.122a | 0.463±0.080a |
| K562NM | 4.733±0.524 | 3.220±0.111 | 3.628±0.103 |
| K562FAM | 4.271±0.682 | 3.439±0.098 | 3.447±0.139 |
注：K562NC组：空白对照；K562MI组：转染miRNA-21抑制物；K562NM组：转染随机序列对照（长度与miRNA-21抑制物相同）；K562FAM组：转染荧光素FAM对照。与其他3组比较，aP<0.01
miRNA能够与靶向特异性的碱基互补配对，导致靶mRNA降解或者抑制靶基因翻译，从而实现对基因转录后表达调控，发挥癌基因或抑癌基因作用[4]。miRNA-21由17q23.2染色体FRA17B脆性区域编码而成，具有自主转录功能[5]。miRNA-21可以调控靶基因的mRNA和蛋白表达，而这些靶基因具有调控细胞增殖、分化、迁移、侵袭等功能[6]。已知miRNA-21在多种恶性肿瘤中表达升高，如恶性胶质瘤、乳腺癌、肺癌、直肠癌、卵巢癌、膀胱癌及食管癌等[7,8,9]。miRNA-21在白血病发病中的作用尚未明确。吴共发等[10]发现下调miRNA-21表达可抑制K562细胞的迁移及增殖能力。朱雪姣等[11]亦发现抑制miRNA-21可以增加K562细胞对阿糖胞苷的敏感性、诱导细胞凋亡。本研究通过化学合成miRNA-21抑制物，经电转染方式靶向抑制miRNA-21的表达，操作简单且实验周期短。在靶向抑制K562细胞miRNA-21表达后，流式细胞术检测发现K562细胞早期凋亡率明显升高，MTT法检测显示K562细胞活力随转染时间的延长逐渐下降，表明靶向抑制miRNA-21对K562细胞具有促凋亡、抑制增殖的作用。
在多种肿瘤中，PTEN均为miRNA-21的靶基因，两者之间存在负性调控趋势，提示miRNA-21可能通过调控PTEN表达影响肿瘤的发生，而PTEN基因作为一种抑癌基因，具有磷酸酯酶活性及蛋白酪氨酸激酶活性[12]。PTEN的表达主要受miRNA （如miRNA-21）、磷酸化、乙酰化、泛素化等转录后调控。研究显示，PTEN可以抑制慢性髓性白血病细胞增殖、侵袭，促进其凋亡[13]。Maehama等[14]发现PTEN可致PI3K的产物磷脂酰肌醇（3, 4, 5 ）-三磷酸（PIP3）脱磷酸，维持PIP3的低水平，从而介导AKT的活化，下调PI3K/AKT通路表达，活化的AKT可以激活多种下游底物，导致肿瘤细胞增殖和耐药，影响肿瘤细胞表型功能，与诊断及预后密切相关，而总AKT表达并无明显变化。本研究中，通过RT-PCR分析发现，miRNA-21与PTEN表达呈负相关，在进一步抑制白血病细胞系K562细胞miRNA-21表达后，转染组PTEN蛋白表达水平显著上调，活性恢复。鉴于PTEN作为一种磷酸酶基因，可以抑制肿瘤细胞生长或是使细胞在早期进入程序性死亡，从而推测miRNA-21可以通过调控PTEN基因表达促进K562细胞的早期凋亡。
以往研究表明，白血病患者PI3K及磷酸化的AKT水平明显高于正常人[15,16]。本研究结果显示，抑制miRNA-21后转染组p-AKT蛋白表达水平显著下调，总AKT水平无明显变化，说明miRNA-21通过增强PTEN活性而负性调控AKT活化，进而影响K562细胞的增殖及凋亡，提示这可能是PTEN-PI3K/AKT信号通路在白血病发病机制中的重要途径。本研究中，我们发现PI3K的蛋白表达也出现下调，考虑不除外miRNA-21下调通过其他途径影响PI3K表达或对PI3K酶活性产生影响，其具体作用机制有待进一步研究。本实验结果显示PTEN基因的蛋白水平变化幅度较大，考虑p-AKT的变化主要还是由于PTEN的作用导致。
本实验结果表明，抑制K562细胞miRNA-21表达可以调控PTEN-PI3K/AKT通路相关分子表达。但是miRNA对应多个靶基因，且miRNA在肿瘤中的调控存在表观调控网络。因此，miRNA-21对于细胞生物学特性的影响是否通过PTEN-PI3K/AKT通路实现有待进一步研究，其对PTEN-PI3K/AKT的作用机制尚需进一步明确。
