薛凤; 覃艳红; 任方刚; 张耀方; 陈秀花; 徐智芳; 常建梅; 许晶; 高峰; 李娟; 尹彬; 刘海霞; 王宏伟

doi:10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.019

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• 短篇论著 •

L型PML-RARα融合基因不同剪接体对ATO作用敏感性的研究

中华血液学杂志, 2017,38(6) : 554-556. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.019

引用本文: 薛凤, 覃艳红, 任方刚, 等. L型PML-RARα融合基因不同剪接体对ATO作用敏感性的研究 [J] . 中华血液学杂志, 2017, 38(6) : 554-556. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2017.06.019.

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急性早幼粒细胞白血病（APL）特征性标志是染色体t（15;17）（q22;q21）易位，并形成PML-RARα融合基因^[1,2,3]。本课题组前期研究发现，PML基因第5、6外显子存在选择性剪接，可形成E5（+）E6（+）（第5外显子和第6外显子均存在）、E5（-）E6（+）（第5外显子缺失）、E5（-）E6（-）（第5外显子和第6外显子均缺失）三种不同的剪接转录本，E5（-）E6（-）剪接体表达量高的患者预后差，三种剪接体对全反式维甲酸（ATRA）表现出不同的敏感性，可能是由于E5（-）E6（-）剪接体失去核定位信号而导致胞质定位，从而表现出对ATRA作用的敏感性较其他两种剪接体差^[4,5]。

治疗APL的另一靶向药物三氧化二砷（ATO）有明确的抗白血病作用，主要通过作用于PML锌指结构域，使PML-RARα融合蛋白被类泛素样蛋白SUMO修饰，进而通过蛋白酶体途径降解来发挥作用^[6,7]。那么对ATRA有不同敏感性的E5（+）E6（+）、E5（-）E6（+）和E5（-）E6（-）三种剪接体对ATO作用的敏感性如何？本研究我们以APL细胞系NB4细胞^[8,9]为研究对象，采用实时荧光定量PCR法对不同剂量ATO诱导细胞凋亡和分化过程中剪接体E5（+）E6（+）、E5（-）E6（+）和E5（-）E6（-）相对表达量的变化进行研究，观察各剪接体对ATO作用的敏感性，现报道如下。

材料与方法

1.　研究材料及主要试剂：

人APL细胞系NB4细胞为本实验室长期保存。ATO购自美国Sigma公司；PBS缓冲液购自武汉博士德生物工程有限公司；青霉素、链霉素双抗购自北京全式金生物技术有限公司；RPMI 1640培养液购自美国Hyclone公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；RNA提取试剂盒购自美国Omega公司；M-MuLV逆转录酶、Premix Ex Taq均购自宝生物工程（大连）有限公司。

2．ATO溶液制备：

参照文献^[10]方法，取60 mg ATO溶解于2 ml 1 mol/L的NaOH溶液中，PBS稀释至浓度为100 µmol/L，-20 ℃避光保存。

3.　实验分组：

实验分为对照组和不同浓度药物处理组，每组设0、24、48、72、96 h 5个观察时间点。取对数生长期状态良好的NB4细胞，按每孔1×10⁶个细胞接种于6孔板。对照组各孔内加入含10% FBS及双抗的RPMI 1640培养液3 ml；药物处理组包括5组，分别加入含终浓度为0.1、0.2、1.0、1.5和2.0 µmol/L ATO的含10% FBS及双抗的RPMI 1640培养液3 ml。将各组细胞置于37 ℃、5% CO₂培养箱内避光孵育。实验设2个复孔。

4.　流式细胞术检测细胞凋亡及分化情况：

在培养0、24、48、72、96 h 5个时间点，收集各组约10⁵个NB4细胞2份，179×g离心5 min，弃上清，用PBS洗涤两次，500 μl Binding缓冲液悬浮细胞。1份按Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡情况；1份加入2.5 μl CD33-FITC和4.5 μl CD11b-PE，混匀，室温避光反应15 min，检测细胞分化情况。实验设2个复管，重复2次。

5.　实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因不同剪接体相对表达量：

收集药物处理组和对照组培养不同时间的NB4细胞，按RNA Kit试剂盒提取总RNA，验证浓度和纯度后，取样品总RNA 1 µg，依据M-MuLV试剂盒说明进行逆转录反应。由于三种剪接体的特殊性及荧光定量PCR片段大小的限制（<150 bp），将相同亚细胞定位的E5（+）E6（+）及E5（-）E6（+）剪接体表达总量用E6（+）表示，并将探针与共同的下游引物设计在RARα的第3外显子区域，而通过分别位于PML第4、6外显子上的两个特异上游引物，将剪接体E6（+）和E5（-）E6（-）进行区分。引物探针序列参照文献^[5]设计，均由上海基康生物技术有限公司合成。PCR体系：cDNA 2 μl，Premix Ex Taq 12.5 μl，DEPC水8.5 μl，上、下游引物（E5-6-F、E5-6-R、E6+F、E6+R）各0.5 μl（10 μmol/L），TaqMan探针1 μl（10 μmol/L），共25 μl。以ABL为内参。反应条件：预变性95 ℃ 10 s；变性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 30 s，共45个循环。为了更为直观比较各剪接体表达量变化，将E5（-）E6（-）剪接体相对表达量采用剪接体表达量/内参ABL表达量×10⁴进行表示，E6（+）剪接体相对表达量采用剪接体表达量/内参ABL表达量×10²进行表示。

6.　统计学处理：

应用SPSS 20.0软件进行数据分析。数据符合正态分布，采用均数±标准差描述，应用重复测量的方差分析比较多组数据间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．ATO分化与凋亡最佳浓度的确定：

随着ATO作用时间的延长，各浓度组NB4细胞呈现不同的分化与凋亡趋势，0.2 µmol/L ATO处理组NB4细胞CD11b的表达上升最为显著（表1），而1.5 µmol/L ATO处理组NB4细胞细胞凋亡最明显（表2）。由此确定ATO作用于NB4细胞呈现分化与凋亡的最佳浓度分别为0.2 µmol/L和1.5 µmol/L。

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表1

不同浓度三氧化二砷（ATO）作用于NB4细胞不同时间后CD11b的阳性率（%，±s）

表1

不同浓度三氧化二砷（ATO）作用于NB4细胞不同时间后CD11b的阳性率（%，±s）

组别		ATO处理时间
组别		0h	24 h	48 h	72 h	96 h
对照组		0.15±0.07	0.10±0.00	0.10±0.00	0.20±0.14	0.10±0.00
ATO处理组
	0.1 µmol/L	0.45±0.07	1.00±0.42	0.45±0.49	0.85±0.21	0.75±0.64
	0.2 µmol/L	0.50±0.14	4.75±0.35	7.90±1.27	9.25±0.35	10.65±0.50
	1.0 µmol/L	0.65±0.07	1.40±0.71	3.45±0.64	3.30±0.71	3.25±0.35
	1.5 µmol/L	0.45±0.21	1.05±0.21	1.25±0.21	0.70±0.14	0.60±0.14
	2.0 µmol/L	0.15±0.07	0.20±0.14	0.40±0.42	0.70±0.28	0.35±0.35

注：每组设2个复孔，实验重复2次

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表2

不同浓度三氧化二砷（ATO）作用于NB4细胞不同时间后细胞凋亡率（%，±s）

表2

不同浓度三氧化二砷（ATO）作用于NB4细胞不同时间后细胞凋亡率（%，±s）

组别		ATO处理时间
组别		0h	24 h	48 h	72 h	96 h
对照组		0.25±0.21	0.20±0.14	0.35±0.35	0.40±0.42	0.50±0.57
ATO处理组
	0.1 µmol/L	0.70±0.14	0.65±0.07	0.70±0.28	0.85±0.49	1.30±0.28
	0.2 µmol/L	0.55±0.07	1.10±0.28	1.05±0.07	1.40±0.14	1.55±0.21
	1.0 µmol/L	0.60±0.14	1.75±0.35	2.75±0.35	18.40±2.26	21.00±1.41
	1.5 µmol/L	0.65±0.21	2.20±0.42	3.00±1.41	18.25±2.47	46.50±2.12
	2.0 µmol/L	1.35±0.92	3.85±1.63	13.35±2.33	0.30±0.14	0.25±0.07

注：每组设2个复孔，实验重复2次

2．E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体表达量变化：

结果见表3，1.5 µmol/L ATO作用于NB4细胞，随着作用时间的延长E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体的表达量均呈逐渐下降趋势，且各时间点与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）（表3）；0.2 µmol/L ATO作用于NB4细胞，随着药物作用时间的延长E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体表达量下降趋势不明显，且各时间点与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）（表4）。同一浓度、同一时间点E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体表达量下降程度差异均无统计学意义（P>0.05）。这一结果提示，各剪接体对不同浓度ATO作用的敏感性差异无统计学意义。

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表3

1.5 µmol/L三氧化二砷（ATO）处理NB4细胞凋亡过程中E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体相对表达量的变化（±s）

表3

1.5 µmol/L三氧化二砷（ATO）处理NB4细胞凋亡过程中E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体相对表达量的变化（±s）

组别	E6(+)					E5(-)E6(-)
组别	处理0 h	处理24 h	处理48 h	处理72 h	处理96 h	处理0 h	处理24 h	处理48 h	处理72 h	处理96 h
ATO处理组	24.44±9.11	10.35±8.58	4.66±1.31	0.27±0.27^a	0.32±0.35 ^a	20.27±15.40	9.92±11.28	7.10±7.30	0.11±0.23^a	0.00±0.00^a
对照组	24.44±9.11	29.97±18.07	14.67±7.55	13.17±11.17	5.39±0.50	20.27±15.40	20.58±20.57	17.44±14.89	22.89±29.39	4.06±1.34

注：^a与对照组比较，P<0.05。每组设2个复孔，实验重复2次

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表4

0.2 µmol/L三氧化二砷（ATO）处理NB4细胞分化过程中E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体相对表达量的变化（±s）

表4

0.2 µmol/L三氧化二砷（ATO）处理NB4细胞分化过程中E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体相对表达量的变化（±s）

组别	E6(+)					E5(-)E6(-)
组别	处理0 h	处理24 h	处理48 h	处理72 h	处理96 h	处理0 h	处理24 h	处理48 h	处理72 h	处理96 h
ATO处理组	24.44±9.11	13.01±0.70	11.44±8.17	14.75±14.06	3.80±1.13	20.27±15.40	15.67±17.67	12.78±21.70	13.51±24.45	0.55±0.42
对照组	24.44±9.11	29.97±18.07	14.67±7.55	13.17±11.17	5.39±0.50	20.27±15.40	20.58±20.57	17.44±14.89	22.89±29.39	4.06±1.34

注：每组设2个复孔，实验重复2次

讨论

目前研究表明，90%以上人类基因经历选择性剪接，与各类疾病均有一定的相关性^[11]，且不同基因剪接异构体对药物作用的敏感性可有不同^[5]。如在成人急性淋巴细胞白血病（ALL）中，由于糖皮质激素受体（GR）存在选择性剪接，形成四种转录本GRα、GRβ、GRγ和GR-P，这些不同转录本在糖皮质激素（GC）抵抗及ALL进展过程中发挥不同的作用，GRα、GRγ高表达与GC抵抗相关而GR-P低表达与GC抵抗相关^[12]。本课题组前期研究发现的PML-RARα融合基因三种剪接体E5（+）E6（+）、E5（-）E6（+）、E5（-）E6（-），由于不同的亚细胞定位而表现出对ATRA作用具有不同的敏感性^[5]。因此，明确不同剪接体对不同药物作用的敏感性，对于指导临床用药及个体化治疗有重要的意义。

ATO在治疗APL中的作用表现突出，目前认为其抗白血病机制在于促进细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制细胞增殖以及抑制骨髓微血管生成等。本研究结果显示，0.2 µmol/L ATO作用NB4细胞后CD11b的表达随作用时间增加呈逐渐上升的趋势，1.5 µmol/L ATO作用后细胞凋亡率随作用时间增加呈明显上升的趋势，与文献[8,13]报道一致。随后我们用荧光定量PCR法检测了剪接体E6（+）、E5（-）E6（-）表达水平，结果表明，最佳分化浓度0.2 µmol/L ATO作用NB4细胞不同时间，各剪接体表达量下降不明显；最佳凋亡浓度1.5 µmol/L ATO作用组E6（+）、E5（-）E6（-）剪接体的表达量呈明显的下降趋势，且同一浓度、同一时间点E6（+）、E5（-）E6（-）两种剪接体表达量下降程度无差异，提示各剪接体虽具有不同的亚细胞定位，但对于ATO表现出同样的敏感性，可能与此药物作用靶点位于各剪接体共有区域的PML基因有关。

综上，我们推测，在APL中L型PML-RARα融合基因三种剪接体对ATO作用敏感且无明显差异，其表达量下降可能主要是通过ATO促凋亡途径发挥作用而实现的，从而将胞质定位的对ATRA作用敏感性差的E5（-）E6（-）剪接体进行降解，故临床上表现出ATRA与ATO两药联合治疗后突出的疗效。下一步我们将构建单一剪接体的慢病毒表达体系，在单克隆细胞水平对各剪接体对ATO作用的敏感性进行进一步探讨。

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薛凤