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阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）是由位于X染色体上的PIG-A基因突变导致的获得性造血干细胞克隆性疾病，其病理缺陷是糖基磷脂酰肌醇（GPI）合成异常而致由GPI锚连在血细胞膜上的一组锚连蛋白（CD55、CD59等）缺失，临床主要表现为血管内溶血、骨髓衰竭、高风险并发血栓等[1,2,3]。PNH经典的诊断方法已不能满足临床所需，被以流式细胞术为代表的现代检测手段而取代；治疗方面，糖皮质激素仍是治疗PNH控制溶血发作的首选，疗效确切，但对激素无效或依赖的难治/复发PNH如何治疗，一直是棘手的问题。重组人源型抗补体C5单克隆抗体及新型补体抑制剂、联合化疗、异基因造血干细胞移植等治疗手段在PNH治疗领域取得了很大进展。本文通过介绍1例经典型PNH患者的诊疗过程，就如何诊治PNH谈谈笔者的认识和经验。
患者，45岁，女性，已婚，主因"间断酱油色尿8年，加重伴乏力1个月余"于2014年8月1日入住我科。入院时查血常规：WBC 7.23×109/L，RBC 2.48×1012/L，HGB 56 g/L，网织红细胞比值（Ret）18.22%，PLT 114×109/L；肝功能：总胆红素（TBIL）52.4 μmol/L、直接胆红素（DBIL）17.6 μmol/L、乳酸脱氢酶（LDH）1 564 U/L；尿常规：潜血（++）、尿胆原（++）、蛋白（+）；凝血功能：D-二聚体6 928 μg/L、纤维蛋白原426.3 g/L；游离血红蛋白399 mg/L、结合珠蛋白带消失；腹部B超示门静脉、肠系膜静脉栓塞；外周血Coombs试验（-）；外周血PNH克隆检测：粒系CD59- 94.89%，红系CD59- 88.82%；气单胞菌溶素前体变异体（Flaer）：CD14-/Flaer- 96.38%、CD24-/Flaer- 88.90%；骨髓涂片及病理均为"增生性贫血骨髓象"。诊断为PNH（经典型）。给予地塞米松0.2 mg·kg-1·d-1，依诺肝素钙抗凝治疗，并辅助碱化、促造血、成分血输注等对症支持治疗，2周后患者尿色明显改善，乏力症状较前减轻；逐渐减少地塞米松剂量，1个月后尿色正常，血常规恢复正常，血清TBIL、LDH较前明显降低，病情好转出院，激素序贯为口服泼尼松30 mg/d，华法林2.0 mg治疗。后患者规律门诊随访调整激素和华法林剂量，目前随访4年，无复发迹象。
（1）血管内溶血证据：血红蛋白尿、血浆游离血红蛋白增高及结合珠蛋白降低、血清乳酸脱氢酶升高，尿潜血和尿含铁血黄素染色（Rous试验）可视为筛查PNH克隆的实验室检查。
（2）骨髓红系造血代偿证据：外周血网织红细胞增高、骨髓涂片和活检均可见红系造血代偿性增生。
（3）补体溶血试验：主要包括Hams试验、糖水试验、蛇毒因子溶血试验和微量补体溶血敏感试验，但上述实验的敏感度和特异度均不高，已逐渐被现代诊断方法所代替。
PNH异常克隆的筛选与识别主要包括以下3种方法，均基于流式细胞术。
（1）检测外周血成熟红细胞和粒细胞CD55和CD59有无缺失：应用流式细胞术检测GPI锚连蛋白缺失细胞数量是诊断PNH最直接、最敏感的方法，已成为诊断PNH的"金标准"。PNH克隆累及造血细胞次序为粒细胞→单核细胞→红细胞→淋巴细胞，确立PNH诊断至少需有一系及以上细胞的两种GPI锚连蛋白缺失[4,5]。由于CD55受输血及溶血的影响较大，CD59敏感度要高于CD55，CD59-粒细胞可最早被检出，有早期诊断价值，且不受输血和溶血的影响。成熟红细胞CD59的检测可将PNH患者红细胞分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
（2）检测骨髓有核红细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞CD55和CD59有无缺失：PNH筛查因为受到输血和溶血的影响常导致检测结果不准确；约5%的患者发生严重溶血或溶血危象，GPI缺乏的红细胞可能会减少，甚至下降到检测限以下，因此只能检测到粒细胞PNH克隆。如果患者合并重型再生障碍性贫血（SAA），可导致粒细胞数量减少，不足以用于检测分析[4,5]。且由于PNH异常克隆起源于造血干细胞，当外周血尚无CD59-细胞时，骨髓中可能已有CD59-细胞。鉴于上述情况检测骨髓中的CD55-、CD59-细胞，可以做到早期诊断。骨髓中的有核红细胞不受输血和溶血的影响，可避免漏诊。
（3）检测Flaer：Flaer是Alexa-488标记的无活性嗜水气单胞菌溶素前体的变异体，可特异性地与细胞膜上的GPI锚连蛋白结合而直接反映锚蛋白的缺失情况。Flaer作用于所有的GPI锚连蛋白，不会因不同细胞表达GPI蛋白种类和多少的不同而造成误差，因而这种针对GPI锚连蛋白进行检测的方法理论上是诊断PNH更敏感、更特异的方法[6]。同检测CD55、CD59相比，Flaer检测结果更加清晰、准确、直观，更敏感、更特异。Flaer对监测PNH微小克隆有重要意义：①监测病情变化以调整治疗及评价免疫抑制治疗效果；②PNH患者移植后微小残留病灶及嵌合状态的检测[7]；③鉴别真假PNH克隆：我科曾收治1例51岁女性患者，主因"乏力伴皮肤巩膜黄染8个月余，加重半个月"入院，血常规示WBC 6.34×109/L，RBC 1.31×1012/L，HGB 46 g/L，Ret 36.86%，PLT 242×109/L；生化示TBIL 30.3 μmol/L、DBIL 10.2 μmol/L、IBIL 20.1 μmol/L、LDH 616 U/L；外周血PNH克隆检测示粒细胞CD59- 0.15%、红细胞CD59- 62.93%，而Flaer结果示CD14-/FLAER- 0.00%、CD24-/Flaer-0.01%，外周血Coombs试验（+），故诊断为自身免疫性溶血性贫血，排除了PNH诊断，造成红系CD59-细胞比例增高的原因可能是由于自身抗体覆盖了部分CD59，导致锚连蛋白检测不到，激素治疗后，CD59又重新暴露，故CD59的检测恢复正常。Sutherland等[8]提出用CD157-PE代替传统的CD24-PE和CD14-PeCy7，敏感性可高达10-4，且通过CD157分析能更好识别Ⅱ型PNH克隆，PNH克隆大小检出率较CD24/CD14也显著升高，分析成本比常规使用的6色分析法低约15%，值得推广应用。
PNH克隆大小与血栓形成比例呈正相关，但微小克隆患者也会伴有血栓形成，由于症状不典型极易漏诊，故早期检测血栓形成指标对判断疾病预后及Eculizumab治疗时机的选择有重要价值。Alashkar等[9]通过对23例PNH和14例AA-PNH患者进行全身MRI检查，首次鉴别出肾血栓及骨血栓，并首次描述了PNH罕见并发症——骨梗死。MRI是一种新的可行的评估PNH血管状态的方法，能够发现既往不易发现的血栓栓塞，对PNH合并血栓患者有重要诊断及预后判断价值。
PNH是由位于X染色体上的PIG-A基因突变导致的造血干细胞获得性克隆性疾病，PIG-A基因突变致GPI合成异常，从而导致由GPI锚连在血细胞膜上的锚连蛋白缺失。因此检测PIG-A基因突变是PNH最特异的诊断方法，但PNH患者中已报道了千余种PIG-A基因的突变位点，未发现突变热点，且偶有正常人亦可检测到PIG-A基因突变，故目前仅限于研究，尚未用于常规诊断。
由于各种检测技术的发展，尤其流式细胞术和分子生物学手段的应用，PNH的诊断取得了突破性进展。该患者以酱油色尿为首发症状，临床表现及实验室检查结果支持溶血性贫血，且影像学检查证实合并了血栓；结合流式细胞术检查PNH克隆及Flaer均支持PNH诊断。
鉴于目前重组人源型抗补体蛋白C5单克隆抗体Eculizumab目前在国内尚未上市，而该患者以急性溶血为首发症状，因此我们依然首选了传统治疗手段：肾上腺糖皮质激素，它可以"保护"PNH克隆、减少补体攻击和破坏、减轻溶血症状，采用糖皮质激素和促造血治疗可使该病的缓解率达60%以上。虽然糖皮质激素治疗PNH具有合理、有效、经济、便捷等优势，但仍有近40%的患者治疗无效，即使治疗后缓解患者仍有超过10%出现复发[10]。如何有效减少PNH克隆，最大限度地控制溶血，又尽可能地减少激素用量，防止激素的不良反应是我们临床工作中亟待解决的主要问题。因此深入探索PNH克隆增殖的机制，开辟新的治疗方向至关重要。
对于激素原发耐药、继发耐药或激素依赖的溶血不易控制、反复发作的骨髓增生良好的PNH患者，为有效地减少PNH异常克隆，最大限度地控制溶血，可采用减低剂量的DA（柔红霉素+阿糖胞苷）或HA（高三尖杉酯碱+阿糖胞苷）方案化疗，为避免出现化疗后骨髓抑制期的严重并发症（贫血、出血和严重感染），化疗采用的剂量宜偏小，疗程亦应缩短；应加强隔离和保护，预防感染；应重用造血因子促进正常克隆恢复。该治疗方案是利用了正常克隆较PNH克隆耐受补体能力强，对造血生长因子反应好，正常造血恢复快的优势，使正常克隆逐步取代PNH克隆而达到治疗目的。我们的课题组[11,12]已证实化疗能够有效地减少PNH克隆负荷、控制溶血、改善贫血，且大大减少了糖皮质激素的用量，是一种较有应用前景的治疗手段。我科曾收治1例22岁的经典型女性PNH患者，溶血症状反复发作，我们给予了大剂量地塞米松（6 mg/d×7 d，静脉滴注），后等剂量泼尼松维持治疗1个月，患者症状改善。泼尼松减量后疾病复发，我们采用了减低剂量的DAG方案（柔红霉素+阿糖胞苷+G-CSF）化疗，第1个疗程化疗结束后，患者溶血症状明显改善，糖皮质激素剂量可减量至最小维持量10 mg/d，粒系CD59-由化疗前82.77%降至44.36%。后门诊规律随诊，目前随访3年无复发迹象。
Eculizumab能特异性地结合到人末端补体蛋白C5，通过抑制人补体C5向C5a和C5b的裂解以阻断炎症因子C5a的释放及C5b-9的形成。众多研究已证实Eculizumab的有效性及安全性：Eculizumab可减少输血需求、改善贫血，缓解与补体介导的慢性血管内溶血相关的症状（如肾功能损害），降低肺动脉髙压和严重血栓事件，最终改善生活质量、延长生存[13,14,15]。但Eculizumab治疗依然存在如下瓶颈[16,17]：①由于该单抗"保护"PNH克隆，治疗期间患者外周血PNH克隆比例显著增加，虽然溶血减少，但其溶血的风险在不断累加；②不能纠正PNH患者的骨髓衰竭；③Eculizumab须精确结合C5发挥作用，C5的多态现象导致小部分PNH患者对Eculizumab耐药；④Eculizumab抑制机体的免疫系统功能，增加了患者对某些严重感染的易感性；⑤Eculizumab价格昂贵，一般患者难以承担。
（1）小分子蛋白酶因子D（FD）抑制剂：FD在免疫系统补体替代途径（AP）的激活及放大过程中起核心作用，其抑制剂可有效阻断AP的激活及防止C3沉积、红细胞裂解[18,19]。Yuan等[20]通过对两种新型的小分子FD抑制剂ACH-3856和ACH-4471在体外的研究，证实极低浓度（0.01 μmol/L）的小分子FD抑制剂就可显著降低补体介导的溶血症状；且ACH-4471可显著降低PNH溶血所致的补体C3片段的沉积，即可改善Eculizumab所致的血管外溶血症状；ACH-4471还表现出良好的口服生物利用度和抑制APC的活性。小分子FD抑制剂可有效改善溶血症状，是口服治疗APC失调疾病的理想靶向药物。鉴于上述研究结果其药理作用、药代动力学特性，ACH-4471已被选定为PNH的临床开发药物，目前正在进行Ⅰ期临床试验。
（2）C3/C5转化酶抑制剂抗C3b/iC3b单克隆抗体：Lindorfer等[21]和Paixão-Cavalcante等[22]先后设计研发了针对补体替代途径更早阶段C3/C5转化酶的抑制剂抗C3b/iC3b（anti-C3b/iC3b）单克隆抗体3E7。3E7作用于C3b/iC3b致使因子B与后者的进一步结合和活化受阻，影响C3（H20）Bb生成，从而抑制C3/C5转化酶的活性，可特异性地阻断补体替代途径活化而不影响经典途径，在有效抑制PNH红细胞溶血的同时，细胞表面补体C3成分沉积无增加[23]。在保留补体经典途径重要免疫功能的同时或可更加有效地改善PNH贫血。美国Alexion公司研发了一种新型治疗性融合蛋白TT30[24,25]，可以CR2依赖方式有效阻止补体替代途径产生的C3碎片在红细胞膜上的沉积，阻断膜攻击复合物的形成，对于PNH血管内和血管外溶血均有抑制作用。TT30是目前最接近向临床转化的治疗策略，其Ⅰ期临床试验正在进行中。
HSCT一般限于那些难治性、耐糖皮质激素或有激素禁忌证的PNH患者，适应证为有HLA相合的同胞供者，且满足以下条件：①合并骨髓衰竭；②难治性PNH，输血依赖性溶血性贫血；③反复出现危及生命的血栓栓塞事件。理论上HSCT是唯一可以治愈PNH的方法，但是PNH为良性病，而HSCT风险大，HLA配型困难，而且Eculizumab的应用全部或部分控制了难治、激素依赖或有激素禁忌证的患者，合适的移植指征目前仍无定论。近几年，Kamranzadeh等[26]、Lee等[27]及国内陈峰等[28]研究均已证实allo-HSCT对于有移植指征的PNH患者疗效确切，且随着移植技术的进步，患者预后不断改善；2016年国内吴德沛教授团队报道了18例接受单倍型HSCT的PNH患者，所有患者均获完全植入及造血重建，预期5年无病生存率为（80.5±10.2）%，无复发病例[29]。在Eculizumab尚未广泛应用的情况下，HSCT可作为一种有价值的治疗手段。
2001年Ji等[30]报道了以反转录病毒为载体，将含正常PIG-A基因有效并稳定地转入PNH患者的异常细胞株内，可使其恢复GPI锚连蛋白的表达。部分PNH患者PNH克隆增殖是由诸如HMGA2、JAK2等基因的二次突变造成，理论上这些患者是可以应用靶向药物治愈的。Katagiri等[31]报道了1例PNH合并CML患者应用尼洛替尼治疗19个月后PNH克隆消失，从而得出结论：BCR-ABL融合基因可诱导PIG-A基因扩增，并可应用靶向药物治愈。但目前为止，基因治疗尚处于初期实验阶段，深入研究PIG-A基因突变及PNH发病机制将有助于PNH基因治疗的突破。
PNH血栓的急性期，应用华法林或低分子肝素抗凝可有效治疗静脉血栓。但部分PNH患者合并骨髓衰竭症状，多表现为重度全血细胞减少，此时进行抗凝治疗风险极大，不仅可致肝素诱导的血小板减少，也可致原有血栓加重或新血栓形成，关于华法林导致的PNH患者颅内出血并致死的病例已有相关报道。因此目前认为华法林预防性抗凝治疗可用于PNH克隆比例较高（粒细胞GPI-AP缺失比例>50%）而无禁忌证的患者[32,33]。对于已经出现血栓栓塞并发症的PNH患者，即使正在应用Eculizumab治疗，若没有禁忌证，应积极抗凝治疗且同时常规应用维生素K拮抗剂。选择性脾动脉栓塞（SSAE）可以使大多数PNH患者减轻腹部静脉栓塞导致的腹痛症状，脾脏缩小，减轻脾功能亢进，提升血小板计数[34]。对于Eculizumab治疗后因血管外溶血仍有输血依赖的患者也可以降低输血需求，效果优于脾切除，对患者生活质量的提高也有获益[35]；对于无血栓合并症的PNH患者，应用Eculizumab治疗可以不必给予预防性抗凝治疗。
该例PNH患者影像学检查明确有血栓栓塞并发症，因此我们首选了肝素类抗凝剂治疗，并序贯华法林口服，门诊监测PT-INR变化以调整华法林用量。
经典的补体溶血试验对于PNH的诊断缺乏敏感性和特异性，流式细胞术（尤其Flaer）和分子生物学手段的应用，使PNH克隆的识别和PNH诊断取得了突破性进展；PNH虽为良性疾病，但起病急骤、病情反复、迁延不愈、患者生活质量差，以糖皮质激素为代表的传统治疗手段对部分初发PNH可取得一定疗效，但对激素无效或依赖的难治性或复发性PNH无效；Eculizumab、联合化疗、HSCT和基因治疗给激素无效或激素依赖的难治性或复发性PNH患者带来了希望。
