评价脐血间充质干细胞（UC-MSC）在难治性重型再生障碍性贫血（RSAA）异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）中的疗效及安全性。
回顾性分析郑州大学附属肿瘤医院2010年3月至2018年7月间接受UC-MSC联合同胞相合供者及无关供者）外周血干细胞移植的25例RSAA患者，其中同胞相合供者组10例，无关供者组15例。
25例患者中男13例，女12例。1例患者原发性植入失败，1例患者血小板植入不良，其余23例患者成功植入。粒细胞、血小板植入的中位时间分别为12.5（10~23）d、15（11~25）d。Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD、慢性GVHD发生率分别为37.5%（9/24）、21.7%（5/23），未发生重度GVHD和严重移植相关并发症。中位随访22.9（1.6~107.8）个月，25例患者中4例死亡，21例（84%）存活，移植后5年总生存率为（83.6±7.5）%。
UC-MSC联合allo-HSCT治疗RSAA疗效确切、安全性好。
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重型再生障碍性贫血（SAA）是严重危及患者生命的骨髓造血衰竭性疾病，造血干细胞移植（HSCT）和免疫抑制治疗（IST）是其主要的治疗手段[1,2]。环孢素A（CsA）联合抗胸腺细胞球蛋白（ATG）是SAA患者的标准一线IST方案，治疗有效率约70%，5年总生存（OS）率为60%~85%[1,2,3]。SAA患者IST后4~6个月仍未脱离输血或血象和骨髓象仍符合SAA标准，称为难治性SAA（RSAA）[4]。异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是RSAA的有效治疗方法。间充质干细胞（MSC）具有低免疫原性、促进造血、免疫调控的特点，动物及临床研究证实MSC与造血干细胞（HSC）共移植可预防GVHD、促进造血[5,6]，因此MSC与HSC共移植可作为RSAA患者的治疗方法[7]。本中心应用同胞相合供者（MSD）及无关供者（UD）外周血干细胞（PBSC）联合脐血MSC（UC-MSC）共移植治疗25例RSAA患者，获得较好的疗效。
本回顾性研究纳入2010年3月至2018年7月在郑州大学附属肿瘤医院接受MSD- PBSC及UD-PBSC联合UC-MSC共移植的25例RSAA患者（表1），诊断标准符合文献[8]。根据供者来源分为MSD组和UD组，其中MSD组10例均为ATG无效/复发患者。所有患者及其监护人均签署移植相关风险同意书，本研究通过我院伦理审查委员会批准。采用高分辨基因分型检测方法，分别检测供者和患者的HLA-A、B、DR、DQ、Cw共10个位点，HLA相合情况见表1。所有患者均采用免疫抑制为主的减低剂量预处理方案，以氟达拉滨（Flu）+ATG+环磷酰胺（Cy）±白消安（Bu）±低剂量全身照射（TBI）为主（11例患者加用2~3 Gy TBI，4例患者加用Bu）。
25例间充质干细胞联合异基因外周血干细胞共移植患者的临床特征
25例间充质干细胞联合异基因外周血干细胞共移植患者的临床特征
| 临床特征 | MSD组（10例） | UD组（15例） | |
|---|---|---|---|
| 患者年龄［岁，M（范围）］ | 18（9～31） | 20（8～42） | |
| 患者性别（例，男/女） | 6/4 | 7/8 | |
| 疾病类型（例） | |||
| SAA | 7 | 7 | |
| VSAA | 3 | 8 | |
| 移植前病程［月，M（范围）］ | 61.0（32.2～169.7） | 48.8（36.3～262.5） | |
| 移植前血清铁蛋白［μg/L，M（范围）］ | 4 151（709～11 814） | 2 706（760～18 220） | |
| 移植前存在活动性感染（例） | 0 | 4 | |
| 移植前IST方案（例） | |||
| CsA+糖皮质激素 | 0 | 14 | |
| CsA+ATG | 10 | 1 | |
| 供受者性别（例） | |||
| 相同 | 5 | 8 | |
| 不同 | 5 | 7 | |
| HLA配型（例） | |||
| 10/10 | 10 | 8 | |
| 9/10 | 0 | 5 | |
| 8/10 | 0 | 2 | |
| ABO血型（例） | |||
| 相合 | 4 | 5 | |
| 不相合 | 6 | 10 | |
| 预处理方案（例） | |||
| Flu+ATG+Cy | 3 | 10 | |
| Flu+ATG+Cy+TBI | 5 | 3 | |
| Flu+ATG+Cy+Bu | 1 | 0 | |
| Flu+ATG+Cy+Bu+TBI | 1 | 2 | |
| 回输MNC［×108/kg，M（范围）］ | 14.9（7.6～22.8） | 10.6（5.1～25.9） | |
| 回输CD34+细胞［×106/kg，M（范围）］ | 6.1（2.5～18.4） | 3.9（2.3～15.0） | |
| 回输UC-MSC［×106/kg，M（范围）］ | 1（1～1） | 1（1～1） | |
注：MSD：同胞相合供者；UD：无关供者；SAA：重型再生障碍性贫血；VSAA：极重型再生障碍性贫血；IST：免疫抑制治疗；MNC：单个核细胞；UC-MSC：脐血间充质干细胞；Flu：氟达拉滨；CsA：环孢素A；ATG：抗胸腺细胞球蛋白；Cy：环磷酰胺；Bu：白消安；TBI：全身照射
所有患者均应用CsA、霉酚酸酯（MMF）、短程甲氨蝶呤（MTX）预防GVHD。从干细胞回输前1周开始，给予CsA 2.5~3.0 mg·kg-1·d-1静脉滴注，恶心、呕吐等症状好转后改为口服4.5~5.5 mg·kg-1·d-1至少1年，维持血药浓度200~400 μg/L，根据GVHD情况进行个体化剂量调整。MMF从干细胞回输后第1天开始口服，成人1.0 g/d，儿童0.5 g/d，+30 d开始减量，+60 d减停。MTX 10 mg/m2于移植后第1、3、6、11天静脉给药。
所有患者均住百级层流病房，预处理前1周始给予肠道抗菌药物预防肠道感染、复方磺胺甲
唑片预防卡氏肺孢子虫病、更昔洛韦预防巨细胞病毒（CMV）感染，预防性应用抗真菌药物。预处理过程中加强水化、碱化尿液，预防出血性膀胱炎；静脉应用前列腺素E1预防肝静脉闭塞病（VOD）。移植期间输注的红细胞及血小板均经辐照处理。
PBSC的动员和采集均根据中华骨髓库制定的标准，全部25例患者中位单个核细胞（MNC）输注量为11.7（5.1~25.9）×108/kg，中位CD34+细胞输注量为4.9（2.3~18.4）×106/kg。UC-MSC来自天津昂赛细胞基因工程有限公司。PBSC输注结束后6 h输注UC-MSC 1×106/kg。
以外周血中性粒细胞绝对计数>0.5×109/L连续3 d为粒细胞植入，PLT>20×109/L连续7 d且脱离血小板输注为血小板植入。采用DNA短串联重复序列-聚合酶链式反应（STR-PCR）检测嵌合体，嵌合体中供者成分>95%、5%~95%分别定义为完全供者嵌合体、混合嵌合体，低于5%为植入失败。采用门诊复查的方式，随访至2019年1月20日。OS时间定义为HSC回输至随访截止或任何原因所致死亡的时间。
应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析。计数资料以例数和百分率表示，OS率分析采用Kaplan-Meier法。
25例患者中，UD组1例患者原发性植入失败（+30 d供者嵌合率为31%，+37 d为0），至今造血未重建，仍为SAA疾病状态，输血依赖；MSD组1例患者+22 d粒细胞植入，至+41 d患者死亡时血小板仍未植入。MSD组1例患者回输同胞PBSC后造血重建较慢，+17 d嵌合率95%，+18 d回输UC-MSC，+25 d嵌合率20.57%，行二次移植，先后回输同胞PBSC和UC-MSC，二次移植后13 d粒细胞植入，14 d血小板植入，嵌合率100%。其余22例患者在回输后30 d内检测嵌合率均为完全嵌合。随访中，植入成功的23例患者中，仅UD组1例混合嵌合（65.8%~92.5%），其余22例患者持续保持完全嵌合状态。MSD组粒细胞、血小板植入的中位时间分别为13（11~23）d、12（11~22）d，UD组分别为12（12~18）d、15.5（11~25）d。详见表2。
25例难治性重型再生障碍性贫血患者移植结果
25例难治性重型再生障碍性贫血患者移植结果
| 临床结局 | MSD组（10例） | UD组（15例） | |
|---|---|---|---|
| 粒细胞/血小板植入成功［例（%）］ | 9（90.0） | 14（93.3） | |
| 粒细胞植入时间［d，M（范围）］ | 13（11～23） | 12（12～18） | |
| 血小板植入时间［d，M（范围）］ | 12（11～22） | 15.5（11～25） | |
| 急性GVHD［例（%）］ | |||
| Ⅰ度 | 1（10.0） | 3（21.4） | |
| Ⅱ度 | 4（40.0） | 1（7.2） | |
| 慢性GVHD［例（%）］ | |||
| 局限型 | 1（11.1） | 2（14.3） | |
| 广泛型 | 0（0） | 2（14.3） | |
| CMV血症［例（%）］ | 7（70.0） | 10（66.7） | |
| EBV血症［例（%）］ | 5（50.0） | 9（60.0） | |
| CMV血症+EBV血症［例（%）］ | 4（40.0） | 9（60.0） | |
| EBV-PTLD［例（%）］ | 0（0） | 1（6.7） | |
| 移植后出血性膀胱炎［例（%）］ | 3（30.0） | 3（20.0） | |
| 移植后细菌感染［例（%）］ | 6（60.0） | 10（66.7） | |
| 重度感染［例（%）］ | 3（30.0） | 5（33.3） | |
注：MSD：同胞相合供者；UD：无关供者；CMV：巨细胞病毒；EBV：EB病毒；PTLD：移植后淋巴组织增殖性疾病
预处理过程顺利，未发生预处理相关的肠道、肝脏、肾脏不良反应，供者干细胞及UC-MSC回输顺利。25例患者中16例（64%）发生移植后细菌感染，包括粒细胞缺乏期感染、血流感染、皮肤软组织感染等，其中重度感染8例（32%）（MSD组3例，UD组5例），4例患者死亡。17例（68%）患者发生CMV血症，14例（56%）患者发生EB病毒（EBV）血症，13例（52%）患者同时存在CMV血症、EBV血症，经更昔洛韦、阿昔洛韦、大剂量静脉丙种球蛋白治疗后病毒转阴，其中UD组2例进展为CMV病（肺CMV感染，抗病毒治疗后痊愈），UD组1例患者进展为EBV相关移植后淋巴组织增殖性疾病（PTLD），经联合利妥昔单抗治疗后痊愈。出血性膀胱炎（HC）6例（24%），尿多瘤病毒检测均为高滴度（>1×103/拷贝），给予水化、碱化、抗病毒等治疗后5例痊愈，UD组1例给予二次回输UC-MSC后痊愈。未发生VOD、毛细血管渗漏综合征、移植相关性血栓性微血管病（TMA）。详见表2。
除外1例原发性植入失败的患者，共9例（37.5%）发生急性GVHD（MSD组5例，UD组4例），中位发生时间为26（4~60）d，均为Ⅰ/Ⅱ度急性GVHD，给予糖皮质激素、MTX、CsA、Ⅱ型TNF受体-抗体融合蛋白等免疫抑制剂治疗后均完全控制。除外+100 d内死亡的1例患者及1例植入失败患者，共5例（21.7%）发生慢性GVHD（MSD组1例，UD组4例），中位发生时间为210（141~240）d，其中局限型3例，广泛型2例，给予糖皮质激素、他克莫司、MMF等免疫抑制剂治疗后4例患者症状得到控制，UD组1例患者移植后持续蛋白尿（24 h尿蛋白定量3~5 g），肾脏穿刺活检病理示"系膜增生性肾小球病伴缺血性肾损伤" ，加用环磷酰胺等免疫抑制剂后得到控制。详见表2。
所有患者中位随访时间为22.9（1.6~107.8）个月，无失访病例。随访期内4例（16%）患者死亡（MSD组1例，UD组3例），死亡原因分别为肺感染+心肾功能衰竭+植入不良+肠道Ⅱ度急性GVHD+消化道出血、肺感染+脓毒症+感染性休克、肺感染+心衰、肺感染+颅内出血。存活的21例患者中1例植入失败，目前带病生存，其余20例患者造血重建后生存状态良好。全部25例患者5年OS率为（83.6±7.5）%，MSD组、UD组移植后5年OS率分别为（90.0±9.5）%、（80.0±10.3）%。随访期内所有患者平均生存时间为91.0（95%CI 75.9~106.1）个月。MSD组、UD组OS曲线见图1。
CsA联合ATG是SAA患者的标准IST方案，有效率约70%，IST后5年OS率为60%~85%[2,3,11]。MSC是从骨髓、外周血、脐血、胎盘或其他组织（如肺、肌肉等）分离获得的具有干细胞样生物学特性基质细胞群体，其生物学特性包括：体外培养条件下对塑料具有黏附性、多向分化潜能、低免疫原性（不表达MHC-Ⅱ类分子和Fas配体，不表达或者低表达MHC-I类分子，也不表达CD80、CD86、CD40、CD40L等共刺激分子）、免疫调控和自我更新能力[12,13]。以动物实验和临床研究为基础，目前MSC已广泛应用于血液病的治疗，尤其是造血干细胞移植，可促进HSC植入、治疗植入失败、植入不良以及预防和改善GVHD[6]。Meuleman等[14]对移植后植入不良的6例患者输注MSC，其中2例造血功能很快恢复。欧洲一项大型多中心研究应用MSC治疗糖皮质激素耐药的急性GVHD，55例患者中30例完全缓解（CR），9例部分缓解（PR）[15]。Lazarus等[16]应用同胞来源的MSC与HSC共移植治疗血液系统恶性肿瘤，统计结果表明，MSC能促进移植后造血功能的恢复，可显著降低急性GVHD的发生率。一些小样本量研究结果显示，仅输注MSC治疗RSAA具有较好的安全性，但造血反应率仅为20%~35%[17,18]，与行二次挽救性IST有效率相当。Si等[19]应用UC-MSC联合allo-HSCT治疗37例儿童SAA患者，粒细胞、血小板植入中位时间分别为14（11~20）d、19（14~29）d，急、慢性GVHD发生率分别为45.9%、18.9%，3年OS率为74.2%。Fu等[20]对5例病史>5年的VSAA患者行UD-HSC联合UC-MSC共移植，4例造血重建，未发生重度GVHD和移植相关并发症。我中心的25例RSAA患者虽病史较长、移植前身体状态差，但移植后中位随访22.9（1.6~107.8）月，仍存活21例，5年OS率为（83.6±7.5）%。
移植后GVHD和植入失败是影响SAA患者allo-HSCT疗效的主要并发症。MSC在体内外均可抑制T细胞、B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞的增殖，可促进造血重建、预防移植物排斥和GVHD的发生，还可用于治疗GVHD[21]。Deeg等[22]回顾分析了87例RSAA患者行UD-HSCT的疗效，HLA全相合组Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD、慢性GVHD发生率分别为69%、52%，HLA 1~3位点不合组Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD、慢性GVHD发生率分别为77%、57%。Lee等[23]报道了50例（46例为ATG联合CsA治疗失败/无效）行UD-HSCT的SAA患者，Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD和慢性GVHD发生率分别为46%、50.3%。本研究急、慢性GVHD的发生率分别为37.5%、21.7%，均在给予免疫抑制剂后得到有效控制，且无重度GVHD的发生，GVHD发生情况与相关文献报道[19,20]一致，比Deeg等[22]和Lee等[23]的报道（仅回输HSC）显著降低。MSD组粒细胞、血小板植入的中位时间分别为13 d、12 d，UD组分别为12 d、15.5 d，比陈欣等[24]报道的显著缩短。1例患者发生原发性植入失败，可能与病史长达16年、输血量大、供受者ABO血型不合、无关供者、HLA抗原8/10有关。以往研究表明，植入延迟与活动性感染有关[25]。MSD组1例患者造血重建前即合并较重的肺部感染，导致植入延迟，+22 d粒系植入，直至+49 d患者死亡血小板仍未植入。Le Blanc等[26]报道了3例行HSCT（仅回输HSC）后植入失败的病例，再次行MSC与HSC共移植后均达到造血重建。本组病例中，1例患者第一次仅回输同胞PBSC，+25 d查嵌合率20.57%，行二次移植，先后回输同胞PBSC和UC-MSC，粒细胞、血小板分别于+13、+14 d植入，嵌合率100%。
值得注意的是，移植后重度细菌感染8例（32%），且直接/间接（部分患者因肺部感染导致心力衰竭、呼吸衰竭死亡，部分患者因感染治疗过程中的并发症死亡）导致了4例患者的死亡。CMV血症、EBV血症发生率分别为68%、56%，两种病毒血症并存占52%，UD组1例患者发展为EBV相关PTLD，可能与其病史长达8年、长期IST、HLA抗原8/10及预处理应用ATG有关。以往研究显示，MSC免疫抑制的特点会导致机体对移植后感染的免疫反应受到抑制，进而使感染相关风险增加[14,27]。Sundin等[27]研究表明，MSC可能会感染CMV且病毒DNA无法在体外培养的MSC中检测到，加之MSC会抑制淋巴细胞增殖，从而使机体抗病毒能力下降。但Karlsson等[28]的体外研究显示，MSC并不能抑制病毒特异性T淋巴细胞的增殖。也有研究显示，移植后感染可能与早期免疫重建不佳、GVHD的发生、激素的长期应用有关，与MSC输注的相关性并不作为首要考虑[26,28]。HC与预处理相关药物（尤其是环磷酰胺）导致膀胱黏膜上皮损伤有关，MSC可参与组织修复过程[29]。本研究UD组1例Ⅳ度HC患者水化、碱化、抗病毒治疗无效，在二次输注UC-MSC后病情很快好转。
对于移植前存在活动性感染且抗感染治疗无效的患者，通过移植达到快速的粒细胞、血小板植入尤为重要。而MSC能调节骨髓微环境、促进造血[5,6,21]，因此联合MSC的HSCT能达到快速造血重建[30]。移植前存在活动性感染的4例患者全部造血重建，重建时间无明显延迟，其中2例患者因粒细胞植入，抗感染治疗有效而获得良好生存。
本回顾性研究结果显示，MSD-PBSC/UD-PBSC联合UC-MSC共移植治疗RSAA安全可行，但仍需扩大样本量、进行随机双盲对照临床试验加以验证。
