探讨基于二代测序检测技术下的克隆性基因突变对第1次完全缓解（CR1）状态下接受高剂量化疗或自体造血干细胞移植（强化巩固治疗）的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性急性髓系白血病（AML）预后的影响。
收集2011年7月至2017年8月在苏州大学附属第一医院CR1状态下接受强化巩固治疗的79例RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者的临床资料，通过Kaplan-Meier曲线、Cox回归模型分析临床因素及突变基因对患者总生存（OS）和无病生存（DFS）时间的影响。
在79例患者中，检出C-KIT、FLT3、CEBPA、DNMT3A基因突变者分别为25例（31.6%）、6例（7.6%）、8例（8.9%）、1例（1.3%），其中C-KIT exon17及C-KIT exon8突变分别为19例（24.1%）、5例（6.3%），FLT3-ITD突变为5例（6.3%）。初诊白细胞计数越高，患者的OS时间越短（P=0.030），合并C-KIT exon17突变患者的OS时间（P=0.010）和DFS时间（P=0.006）明显缩短，合并FLT3-ITD基因突变患者的OS时间（P=0.048）和DFS时间（P=0.071）缩短。多因素分析显示合并C-KIT exon17和FLT3-ITD突变均为影响患者预后的独立因素。
在接受强化巩固治疗的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者中，C-KIT exon 17、FLT3-ITD基因突变提示预后较差，这将对细化患者危险度分层、个体化治疗、评估预后有指导意义。
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急性髓系白血病（AML）是一种常见的恶性血液病，其中RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML的发病率占AML的12%~15%[1]。RUNX1-RUNX1T1融合基因由t（8;21）（q22;q22.1）形成，此类AML多见于FAB分型中的M2型，根据美国国家综合癌症网（NCCN）（2018）指南此类AML归为低危组，诱导缓解后的巩固治疗可选择高剂量化疗或自体造血干细胞移植（auto-HSCT）。近来一些大数据研究显示低危组AML选择auto-HSCT的疗效与异基因造血干细胞移植相同甚至更优[2,3]。已有研究表明伴不同基因突变的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML，其临床及实验室特征、预后不尽相同[4,5]。在本研究中，我们旨在通过分析我院接受高剂量化疗或auto-HSCT的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者的临床特征、实验室结果及预后，评价基于二代测序（NGS）检测技术下克隆性基因突变的预后价值，以期更好地协助诊治，指导临床决策。
回顾性分析2011年7月至2017年8月就诊于我院血液科的初治RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者共211例。排除未接受治疗或失访患者、经治疗未达完全缓解（CR）的患者、行异基因造血干细胞移植患者、不能严格执行高剂量巩固化疗者，将其中接受高剂量巩固化疗（65例）或auto-HSCT（14例）的79例患者纳入研究。对患者初治骨髓标本进行细胞形态学、免疫学、细胞遗传学及分子遗传学（二代测序）等检测，统计分析患者的一般临床资料、实验室检查、治疗方案、随访结果等临床资料。
所有患者依照成人AML中国诊疗指南[6]，接受阿糖胞苷联合蒽环类药物（"3+7"方案）为基础的标准诱导化疗方案，诱导化疗达到CR后采用大剂量阿糖胞苷（3 g/m2，每12 h 1次，6个剂量）3~4个疗程。结合患者意愿及经济状况选择性进行auto-HSCT治疗。
对79例初诊RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者骨髓标本提取基因组DNA，利用Ion Torrent S5 NGS测序平台（美国ThermoFisher公司）对患者49个基因（ASXL1、ASXL2、BCOR、BCORL1、BIRC3、BRAF、CALR、CBL、CDKN2A、CSF3R、CSMD1、DNMT3A、ETNK1、ETV6、EZH2、FBXW7、FLT3、GATA2、IDH1、IDH2、IL7R、JAK1、JAK2、JAK3、KIT、KRAS、MPL、MYD88、NOTCH1、NRAS、PAX5、PDGFRA、PDGFRB、PHF6、PIGA、PTEN、PTPN11、RUNX1、SETBP1、SETD2、SF3B1、SH2B3、SRSF2、STAG2、TET2、TP53、U2AF1、WT1、ZRSR2）进行靶向扩增子法深度测序，并用PCR-毛细管电泳法检测FLT3-ITD突变，Sanger测序法检测CEBPA和NPM1第12号外显子突变。
NGS扩增子测序法引物由ThermoFisher公司设计、合成；采用Ion AmpliSeqTM试剂盒2.0制备文库，PCR初始模板量为12~16 ng；采用Ion library TaqMan quantitation kit对文库进行实时定量PCR检测；采用Ion 540TM OT2试剂盒进行乳液PCR和ISP富集，最后使用540芯片上机测序。
NGS测序结果由Ion Torrent S5仪器自带软件和插件进行初步分析，得到该540芯片上样率、人类基因组参考序列匹配度、整体数据量和中位测序长度等，还可获得每个标本的在靶率、平均深度、均一度、BAM及VCF文件等数据。最后对VCF文件进行注释，并用IGV软件查看BAM文件进行确认，以排除假阳性（在靶率97%~99%，平均深度2 000×，均一度94%~97%，中位测序长度195 bp）。
随访方式包括电话、门诊记录、医院病例登记系统等。自患者确诊之日起进行随访，随访截至2018年5月1日，总生存（OS）时间定义为从确诊日期至患者死亡或末次随访日期。无病生存（DFS）时间定义为患者化疗后达到CR至疾病复发、死亡或末次随访日期。复发定义为血液或骨髓中的原始细胞再次>0.05或在达到CR后的任何髓外部位复发。
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料以百分率表示，采用Kaplan-Meier法描绘生存曲线。单因素分析中P<0.1的因素纳入Cox回归模型进行多因素分析。单因素及多因素分析均以P<0.05为差异有统计学意义。
接受高剂量化疗或auto-HSCT的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者共79例，其中男50例，女29例，中位年龄43（18~62）岁，初治中位WBC 11.71（1.23~46.70）×109/L，初诊时患者的中位骨髓原始细胞比例为0.420（0.050~0.980），外周血原始细胞比例0.36（0.02~0.83）。初治时46例有附加染色体异常，诱导治疗下>1个疗程达到CR者7例，在第1次CR（CR1）状态下进行auto-HSCT者14例。
79例接受高剂量化疗或auto-HSCT的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者的骨髓样本均接受基因测序。在79例患者中，C-KIT突变发生率最高，共检出25例（31.6%），突变类型主要有：C-KIT exon8（D419fs）、C-KIT exon17（D816H、D816V、D820Y、N822K），其中17号外显子突变（19例，24.1%）较8号外显子突变（5例，6.3%）发生比例高。其次为FLT3基因突变，共检出6例患者（7.6%），其中FLT3-ITD突变5例（6.3%）；CEBPA突变共7例（8.9%）（图1）。
我们将可能影响预后的临床因素及基因突变进行预后单因素分析（表1），其中基因突变选择突变例数较多的C-KIT exon8突变、C-KIT exon17突变、FLT3-ITD突变及CEBPA突变。单因素模型分析发现：初治WBC越高，患者的OS期越短（P=0.030），但与DFS无统计学相关性（P=0.714），余临床特征与OS及DFS无明显相关性。基因突变中，合并C-KIT exon17突变的患者OS及DFS明显缩短（P=0.010，P=0.006），而合并FLT3-ITD突变的患者OS较差（P=0.048），DFS差异未见统计学意义（P=0.071）。合并C-KIT exon17突变及FLT3-ITD突变的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性AML患者生存曲线见图2、图3。C-KIT exon17基因突变阳性患者的2年OS率为18.5%，2年DFS率为18.3%，FLT3-ITD突变阳性患者均在半年内死亡，故未进行2年OS率及2年DFS率统计。
接受强化巩固化疗的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性急性髓系白血病患者预后单因素分析
接受强化巩固化疗的RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性急性髓系白血病患者预后单因素分析
| 因素 | 总生存 | 无病生存 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| OR值 | 95%CI | P值 | OR值 | 95%CI | P值 | |
| 男性 | 0.761 | 0.370～1.564 | 0.457 | 0.737 | 0.358～1.518 | 0.408 |
| 年龄≥45岁 | 1.013 | 0.986～1.040 | 0.354 | 1.015 | 0.987～1.043 | 0.298 |
| 初诊WBC≥10×109/L | 1.890 | 1.003～1.054 | 0.030 | 1.006 | 0.976～1.036 | 0.714 |
| LDH≥320 U/L | 1.445 | 0.717～2.913 | 0.303 | 1.419 | 0.704～2.859 | 0.328 |
| 初诊骨髓原始细胞≥0.450 | 1.731 | 0.828～3.618 | 0.145 | 1.682 | 0.807～3.503 | 0.165 |
| 初治外周血原始细胞≥0.45 | 1.003 | 0.982～1.024 | 0.784 | 1.025 | 0.348～3.024 | 0.964 |
| 附加染色体异常 | 0.907 | 0.447～1.838 | 0.786 | 0.935 | 0.461～1.896 | 0.852 |
| CD19阳性 | 0.909 | 0.437～1.890 | 0.797 | 0.920 | 0.443～1.913 | 0.824 |
| C-KIT exon8突变 | 1.707 | 0.518～5.622 | 0.379 | 1.741 | 0.527～5.746 | 0.363 |
| C-KIT exon17突变 | 2.531 | 1.247～5.138 | 0.010 | 2.672 | 1.318～5.417 | 0.006 |
| FLT3-ITD突变 | 2.932 | 1.012～8.496 | 0.048 | 2.664 | 0.921～7.705 | 0.071 |
| CEBPA突变 | 0.563 | 0.169～1.879 | 0.350 | 0.692 | 0.208～2.297 | 0.547 |
将单因素Cox模型中P值<0.1的三种因素（初治WBC、是否合并C-KIT exon17突变、FLT3-ITD突变）代入多因素Cox模型中进行分析，结果显示，合并C-KIT exon17突变[OR=3.381（95%CI 1.549~7.378），P=0.002；OR=3.533（95%CI 1.510~6.692），P=0.002]、FLT3-ITD突变[OR=4.343（95%CI 1.413~13.346），P=0.010；OR=3.947（95%CI 1.289~12.082），P= 0.016]均为影响RUNX1-RUNX1T1阳性AML患者OS及DFS的独立因素。
RUNX1-RUNX1T1融合基因是由21号染色体与8号染色体易位形成[7,8,9]，合并此类融合基因的白血病通常被认为预后良好，高剂量化疗或auto-HSCT即可取得较好预后。但在随后的研究中发现临床因素会对预后产生不同影响，如多个中心的研究均证明RUNX1-RUNX1T1阳性AML通常初治WBC不高。德国及法国的研究中WBC中位数为（9~10）×109/L[10,11,12]，本研究中接受单纯化疗及auto-HSCT的RUNX1-RUNX1T1阳性AML患者中位WBC为11.71×109/L，同国外数据较接近。多个中心数据显示WBC增高影响预后[10,12]，本研究数据提示患者初治WBC较高则OS较差。
研究证实单纯RUNX1-RUNX1T1融合基因并不足以导致白血病的发生，在白血病的"二次打击"学说中，RUNX1-RUNX1T1融合基因属于第二类突变，需联合第一类突变共同作用形成白血病。多个文献报道t（8；21）AML可合并多种基因突变，如C-KIT、FLT3、CEBPA、NPM1等[13,14,15]，其中最常见的是C-KIT基因突变[16,17]。而这些基因突变发生情况各不相同，且对患者预后产生影响。综合目前的报道，C-KIT基因可见于25%~40%的t（8；21）AML患者[13,18,19]，我们的数据显示C-KIT基因突变在接受单纯化疗及auto-HSCT的RUNX1-RUNX1T1阳性AML患者中的发生率为31.6%左右，其中17号外显子突变的发生率较高,同文献[20,21]研究结果相仿。本研究的随访结果显示，合并C-KIT基因突变的接受单纯化疗及auto-HSCT的RUNX1-RUNX1T1阳性AML患者的OS、DFS较差，且不易受其他合并基因的影响，与既往研究结果相似[22,23,24]。C-KIT基因突变中17号外显子突变对预后影响较大，这可能与D816突变发生率高、预后差有关[25]，但仍需进一步研究证实。
FLT3基因突变在成人AML中发生率约20%[26]，其中FLT3-ITD突变发生率较高[27]，本研究中的突变发生率与国际及国内大数据样本相仿。既往研究表明FLT3基因突变往往提示预后不良，且较易复发[28]，其中FLT3-ITD基因突变与较差预后关系更密切[29]。在本研究中，接受auto-HSCT及单纯化疗的患者如合并FLT3-ITD突变OS、DFS均降低，且为独立危险因素，不受其他因素影响。
本研究结果表明，RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性的AML患者，初治时高WBC、合并C-KIT exon17、FLT3-ITD基因突变均提示预后较差，提示我们在临床治疗过程中应常规进行基因检测。RUNX1-RUNX1T1融合基因阳性的AML患者一般预后较好，但对于高危患者是否提前考虑异基因造血干细胞移植治疗，以改善患者预后，值得进一步临床研究。
